200461. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új 9-(N-hidroxi-alkoxi)-purin-származékot és ilyen vegyületeket tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására

1

HU 200461 B

2

dékkal (5 % újszülött boíjú szérumot tartalmaz) készült hígításait adagoljuk, mindegyik lyukba 0,5 ml folyadékot rétegezve. A kísérleti vegyületet úgy hígítjuk, hogy a következő koncentrációsorozatot kapjuk: 200, 60, 20, 6...0.06 |ig/ml; így tehát a vizsgált kísérleti tartományban a végső koncentráció 100 pg/ml és 0,03 pg/ml közötti. A fertőzött kultúrákat 37 °C-on 5 térfogat % szén- dioxidot tartalmazó, nedvesített atmoszférában inkubáljuk addig, míg a plakk-képződés láthatóvá válik (5 vagy 6 nap).

Az 1. és 2. tesztben nyert kultúrákat formaldehidet tartalmazó fiziológiás sóoldattal fixáljuk, majd a felülső agarózréteget gondossan lemossuk és a sejt-egyréteget carbol-fuchsin nevű festékanyaggal színezzük. Sztereomikroszkópot használunk a plakkok megszámlálásához. Kiszámítjuk a kísérleti vegyületek IC50 értékét, azaz azt a koncentrációjukat, amely a plakkszámot 50 %-kal csökkenti a csak vírussal kezelt kontroll egyrétegeknél tapasztalható plakkszámhoz képest. Megvizsgáljuk továbbá az egyrétegeket a hatóanyag által kiváltott citotoxicitás jeleit illetően, és feljegyezzük azt a minimális koncentrációt, amelynél citotoxicitás fordul elő.

3. CPE-gátlási teszt (replikáiddá sejtek) 1. típusú herpesz simplex vírusra

MRC-5 sejteknek 5 % újszülött boíjú szérumot tartalmazó Eagle’s MEM-oldattal készült szuszpenzióját megfertőzzük SCI6 törzsbe tartozó herpesz simplex vírussal, 10 sejtre közel egy fertőző részecskét használva. A megfertőzött sejtszuszpenzióból 100-100 mikrolitert (közel 2.104 sejtet tartalmaz) bemérünk olyan 96 lyukú mikrotitrálólemez lyukaiba, amelyek azonos térfogatban tartalmazzák a kísérleti vegyületnek 5 % újszülött borjú szérumot tartalmzó Eagle’s MEM-oldattal készült keverékét 200 pg/ml és 0,09 pg/ml közötti koncentrációiban (háromszoros hígítás után); így a végső koncentráció 100 jJg/ml és 0,045 pg/ml közötti. A lemezeket ezután 37 °C-on 5 térfogat1^ szén-dioxidot tartalmazó, nedvesített atmoszférában 3 napon át inkubáljuk, amikorra a kontroll

lyukakba a vírusok által kiváltott citopatikus hatás (CPE) 100 %-ot ér el. A lemezeket ezután formaldehidet tartalmazó fiziológiás sóoldattal rögzítjük, majd cárból fuchsin-nal megfestjük. A lemezeket ezt 5 követően vizsgálatnak vetjük alá annak megállapítására, hogy a kísérleti vegyületeknek mely koncentrációja csökkenti a vírus által kiváltott CPE-t 50 %-kal (IC50). Párhuzamosan nem fertőzött sejteket tartalmazó lemezeket is vizsgálunk annak megállapí- 10 tása céljából, hogy a kísérleti vegyületnek mekkora minimális koncentrációja okoz citotoxicitást.

4. CPE-gátlási teszt (kialakult egyréteg) lentivírusokra

15 96 lyukú mikrotitrálólemez egyes lyukaiba 3.104

bárány koraid plexus (SCP) sejtet juttatunk 100 |xl, Hanks-sókat és 10 % hővel inaktivált borjúembriószérumot (FCS) tartalmazó Eagle’s MEM-oldatban. Miután az egyrétegek kialakultak (1 vagy 2 napos 20 növekedés után), 200 pl fenntartó közeggel (Hankssókat és 0,5 % FCS-t tartalmazó Eagle’s MEM) mossuk és ezután visna vírusnak (KI84 törzs) a fenntartó közeggel készült keverékéből (30 TCID5o/ml) 100 pl-rel megfertőzzük az egyrétegeket 25 Kísérleti mintákat további 96 lyukú mikrotitrálólemezekben hígítunk a 200-0,09 pg/ml tartományra háromszoros higítási lépésekben. A hígított mintákból 100-100 jj-l-t ezután közvetlenül a vírusfertőzött egyrétegekre (így a végső koncentrációtartomány 100- 30 0,045 pg/ml). Ezt követően 37 °C-on 5 térfogat % szén-dioxidot tartalmazó, nedvesített atmoszférában inkubálást végzünk, míg a vírusok által kiváltott CPE maximális a kezeletlen vírusfertőzött kontrolloknál (rendszerint 12-14 nap). A lemezeket ezután formal- 35 dehidet tartalmazó fiziológiás sóoldattal fixáljuk, majd kristályviolával megfestjük. A vírusok által kiváltott CPE-t ezután mikroszkóposán értékeljük és a sejtegyrétegek teljes megvédését biztosító minimális koncentrációt (MIC) megállapítjuk.

40 A kapott eredményeket a következő táblázatban adjuk meg.

Eredmények

A példa sorszáma

1. típusú herpesz simplex HFEM törzs SCI6 törzs Vera MRC-5 sejtekben sejtekben

IC5o(pg/m)a 2. típusú herpesz simplex MS törzs MS törzs Vera MRC-5 sejtekben sejtekben

Varicella zoster vírus Ellentörzs MRC-5 sejtekben

MIC

(pg/ml)

Visna vírus KI84 törzs SCP sejtekben

1.

0,4;0,2

1,0;0,3;0,2

0,3;0,2

0,1

0,8;0,3

3,0

2.

4,3

0,4;0,6

1,1

3.

2,8

1,2

2,1

4.

100

67

21

5.

1,5

1,8;1,8

1,5;1,5

1,5

2,9

0,1

6.

8,6

1,9

1,6

0,7

2,3

10

7.

100

57

8.

11

30

11.

0,7

0,1

0,1

14.

100

15.

7,4

a) mindegyik szám egyetlen tesztben kapott érték

16