200423. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a sebgyógyulást gyorsító, IGF-II-t tartalmazó gyógyszerkészítmény előállítására
5 HU 200423 B 6 olyan mennyiségben alkalmazzuk, hogy a seb minden emsére körülbelül 1-500 pg IGF-II kerüljön. Az alkalmazott IGF-II előnyös mennyisége körülbelül 30-300 pg/cm2, méginkább 50-200 pg/cm2, legelőnyösebben viszont 60-100 pg/cm2. A kővetkező példák a találmányt szemléltetik, nem korlátozzák azonban annak oltalmi körét. Az .ismert módon előállított' kifejezés a jelen találmány elsőbbségi napja előtt publikált eljárásokat öleli fel. 1. példa Az Escherichia coli RV308/pCZ20 törzs tenyésztése és a pCZ20 plazmid izolálása A) Az Escherichia coli RV308/pCZ20 törzs tenyésztése 100 ml, 50 jug/ml kanamicin-szulfátot tartalmazó TY táptalajt (10 g tripton, 5 g élesztőkivonat és 5 g nátrium-klorid literenkét) oltunk az E. coli RV308/pCZ20 törzs (e törzs a Northern Regional Research Center tőrzsgyújteményében NRRL B-15881 azonosító szám alatt letétben található) egy tenyészetével, és körülbelül 16 órán át 20-25 °C hőmérsékleten rázatva inkubáljuk. Ezután a tenyészet 100 ml-ét 900 ml, 50 jug/ml kanamicinnel kiegészített TY táptalajt tartalmazó lombikba töltjük át. A felhígított tenyészetet 37 °C hőmérsékleten 2-3 órán át rázatva ínkubáljuk. A 37 °C tenyésztési hőmérséklet magas sejtenkénti plazmid-példányszámot indukál. B) A pCZ20 plazmid izolálása A sejteket centrifugálással (4 °C hőmérsékleten, 10 000 percenkénti fordulatszámmal, 5 percig) ülepítjük, majd a sejtüledéket 2 mg/ml lizozim enzimmel kiegészített, 20 ml térfogatú, 25 mmól 8-as pH-jú Tris-HCl-t, 10 mmól etilón-diamino-tetraecetsavat (EDTA) és 50 mmól glükózt tartalmazó oldatban felszuszpendáljuk. A sejtszuszpenziót 15 percen át jégfürdőn inkubáljuk, majd 40 ml, IX nátrium-lauril-szulfátot (SDS) és 0,2 n nátrium-hidroxidot tartalmazó oldatot adunk hozzá, és az elegyet összekeverjük. Miután a sejtek teljes mértékben lizáltak, 30 ml 4,8 pH-jú, 3 mól koncentrációjú nátrium-acetát-oldatot adunk a szuszpenzióhoz, az Így nyert oldatot összekeverjük, és 1 órán át jégfürdőben inkubáljuk. Ezután az oldatot 20 000 percenkénti fordulatszámmal 30 percen ét centrifugáljuk. A centrifugálás után az üledéket eldobjuk, a felülúszóhoz pedig 3 térfogatnyi hideg, abszolút etanolt adunk. Az így nyert elegyet -70 °C hőmérsékletre hűtjük 10-20 percre, majd 10 000 percenkénti fordulatszámmal 10 percen ét centrifugálva kiülepítjük a dezoxi-ribonukleinsavat. A DNS-üledéket 10 ml TE-pufferban (10 mmól- 7,5-es pH-jú Tris-HCl és 1 mmól etilén-diamino-tetraecetsav oldata) felszuszpendáljuk, ezután pedig 0,1 ml, 5 mg/ml koncentrációjú ribonukleáz-A-oldatot és 10 pl, 2500 egység/ml koncentrációjú ribonukleáz-T-oldatot adagolunk. Az így nyert oldatot 65 °C hőmérsékleten 20 percen át inkubáljuk, majd 30 g cézium-kloridot adunk hozzá. Az oldat térfogatát 38 ml-re állítjuk be TE-puffer hozzáadásával. 2 ml etidium-bromid-oldatot mérünk az oldathoz, és 49 000 percenkénti fordulatszámmal, 17 órán át, vertikális rotorban ultracentrifugáljuk, hogy a plazmid DNS-t egy vékony folyadéksávból gyűjthessük össze. Miután a plazmid DNS-t tartalmazó fázist összegyűjtöttük az ultracentrifuga csőből, az etidium-bromidot cézium-kloriddal és vízzel telitett izopropanollal kiextrahéljuk, á cézi-. um-kloridot pedig TE szemben végzett dialízissel távoli tjük el. Az igy nyert. pCZ20 plazmid DNS-t 1 pg/ml koncentrációban, TE-pufferban szuszpendáljuk fel, és az oldatot -20 °C hőmérsékleten tároljuk. 2. példa A pCZ2Q plazmid 0,43 kb nagyságú, trpLEl-t kódoló EcoRI restrikciós fragmensének elkülönítése Mintegy 30 /ul (30 /ug), a fentiek szerint eljárva izolált pCZ20 plazmid DNS-t adunk 10 pl 10X EcoRI puffer (1,5 mól Tris-HCl, 7,2 pH-jú; 500 mmól nátrium-klorid; és 10 mmól ditio-treitol oldata), 2 pl EcoRI restrikciós endonukleéz enzim (60 egység) és 58 pl viz elegyóhez. összekeverés után a reakcióelegyet 1 órára 37 °C hőmérsékletű vízfürdőbe helyezzük, majd az oldatot IX koncentrációjú agaróz gélen elektroforetizéljuk, amíg a kívánt, 0,43 kb nagyságú EcoRI fragmens világosan elkülönül a többi emésztési terméktől. Az elektroforetizált DNS-t úgy tesszük láthatóvá, hogy a gélt hígított etidium-bromid-oldattal (0,5 pg/ml) megfestjük, a festett gélt pedig hosszúhullámú ultraibolya-fénnyel világítjuk meg. A kívánt fragmens helyzetének megállapítása után keskeny vágást ejtünk a gélen, és a hasítékba egy kis darab Schleicher és Schuell (Keene, NH 03431) NA-45 DEAE szűrőpapírt helyezünk. A további elektroforézis során a DNS szűrőpapírt helyezünk. A további elektroforézis sorén a DNS nem-kovalensen hozzákótódik a DEAE szűrőpapírhoz. Miután a kívánt fragmens hozzákötódőtt a DEAE szűrőpapírhoz, a szűrőpapírt kiemeljük a gélből, és kis sótartalmú pufferrel (150 mmól nátrium-klorid; 0,1 mmól etilén-diamino-tetraecetsav és 20 mmól 8-as pH-jú Tris-HCl oldata) mossuk. Ezután a szűrőpapírt egy kisméretű csőbe helyezzük, nagy sókoncentréciójú pufferba 5 5 10 , v 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
