200423. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a sebgyógyulást gyorsító, IGF-II-t tartalmazó gyógyszerkészítmény előállítására
7 HU 200423 B I. Táblázat 8 (1 mól nétrium-klorid; 0,1 mmól etilén-diamino-tetraecetsav és 20 mmól Tris-HCl, 8-as pH-jú oldata) merítjük, és 65 °C hómérsékleten 1 órán át inkubáljuk, hogy a DNS-t eltávolitsuk a DEAE szűrőpapírról. Az inkubáció után az inkubáló puffert összegyűjtjük, a szűrőpapírt pedig nagy sókoncentrációjú pufferral mossuk. Mielőtt a kívánt DNS-fragmenst kinyernénk, a mosóoldatot egyesítjük ‘az inkubáló oldattal. A nagy sótartalmú DNS-oldat nátrium-klorid koncentrációját hígítással 0,25 mól-ra állítjuk be, és 3 térfogatnyi mennyiségű hideg, abszolút etanolt adunk hozzá. Az így nyert oldatot összekeverjük, és 10-20 percen át -70 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A fagyasztás után az oldatot 15 000 percenkénti fordulatszámmal 15 percen ét centrifugáljuk. A maradék só eltávolítása érdekében végzett újabb kicsapást követően a DNS-üledéket etanollal mossuk, megszáritjuk, és 20 <uű TE-pufferban felszuszpendáljuk. Az Így nyert oldat tartalmazza a kivént, trpLEl-t kódoló EcoRI restrikciós fragmens mintegy 0,25 Mg-ját. 3. példa Az IGF-II-t kódoló DNS előállítása Az IGF-II gén kódoló részének szintézisét a következő általános eljárás szerint hajtjuk végre: A) a tökéletesített foszfo-triészter módszerrel 38 egyszálú, 9-15 dezoxi-ribonukleotidból álló dezoxi-ribo-oligonukleotidot szintetizálunk; B) a 38 egyszálú DNS molekula közül néhányat foszforizálunk; és C) egy sor összeolvasztási és ligálési reakciót végezve két kettősszálú DNS molekulát állítunk elő, melyek mindegyike a gén kódoló részének körülbelül a felét tartalmazza. Végül a fentiek szerint előállított két fragmenst a pBR322 plazmidba építjük be, a teljes 1GF-II kódoló szekvenciát egyetlen DNS molekulában egyesítve. Az A-C lépéseket részletesebben az alábbiakban ismertetjük. A) Egyszálú DNS fragmensek szintézise Az alábbi, I. táblázatban felsorolt 38 dezoxi-ribo-oligonukleotidot Hsiung és munkatársai [Nucleic Acids Research, 11, 3227 (1983)] tökéletesített foszfo-triészter módszere szerint szintetizáljuk. Számos ismert, az egyszálú fragmensek szintézisére alkalmas DNS-szintetizáló készülék szintúgy felhasználható. Szekvencia Méret i AATTCATGGCT llmer 2 TATCGACCGTCT 12mer 3 GGCGGCGAACTG ' 12mer 4 AAGCCACGGT lOmer 5 GTTGACACTCTG 12mer 6 CGCCGCAAACGA 12mer 7 GCTTCTACTTC llmer 8 TCTCGTCCGG lOmer 9 CTTCTCGTGTTT 12mer 10 CTAGACGTTC lOmer 11 TCGTGGCAT 9mer 12 CGTTGAAGAATG 12mer 13 TCTTGCGACCTG 12mer 14 CAGTTCGTTTGC 12mer 15-GCTCTGCTGG lOmer 16 AAACTTACTGC llmer 17 GCTACTCCTGCT 12mer 18 AAATCTGAATAATAG 15mer 19 CGATAAGCCATG 12mer 20 GTTTCAGACGGT 12mer 21 CAACCAGTTCGC 12mer 22 ACTGCAGAGTGT 12mer 23 CTGCTTCCGC lOmer 24 GGCGACCGTG lOmer 25 GAGAGAAGTAG llmer 26 GAAGCCGGAC lOmer 27 CTAGAAACACGA 12mer 28 ACGAGAACGT lOmer 29 AACGATGCC 9mer 30 AAGCAGCATTCTTC 14mer 31 TCGCAAGAGCGG 12mer 32 CAGAGCCAGG lOmer 33 AAGTTTCCAG lOmer 34 AGTAGCGCAGT llmer 35 AGATTTAGCAGG 12mer 36 GATCCTATTATTC 13mer 37 GAAACTCTGTGC 12mer 38 CGCCGCACAGA llmer B) A foszforilálás Miután vékonyréteg-kromatográfiával és fordított fázisú, nagynyomású folyadék-kromatográfiával valamennyi oligonukleotidot megtisztítottuk, az I. táblázatban felsorolt 38 egyszálú DNS-fragmens közül néhányat Shiung és munkatársai (1983, lásd fentebb) ajánlásai szerint foszforilálunk, hogy megkönnyítsük a ligálást, és az IGF-II gént kódoló DNS-fragmens összeállítását. Néhány fragmens, amint azt jelöltük, 5'-végén ,32p -_t hordoz, mivel a foszforilációs reakcióban nyomjelzéshez szükséges mennyiségben gamma-32P-ART-t használunk fel. C) Az összeolvasztás és a ligálás Az 1., a 2., a 3., a 19., a 20., a 21., a 37. és a 38. fragmenst összeolvasztva, majd ősszeligálva előállítjuk az I-es duplexet: 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
