200367. lajstromszámú szabadalom • Eljárás indanomicin és homoindanomicin, valamint ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 200367 B 2 Mikromorfológia: A spóratartók morfológiája azonos a Streptomyces galbus típus törzsekével: különböző tápagar közegeken, variálva laza vagy tömött, 3-8 kanyarulatú spirál vagy retinaculum-apertum típusú spóraláncok képződnek, melyekben általában több mint 50 spóra helyezkedik el. A spórák nem omamentáltak és hatezerszeres nagyításnál sima felületű spóraburokról tanúskodnak. A törzs ISP-táplalajokon erőteljesen fejlett, sárgásbarna telepeket fejleszt, amelyeket porszem, hamuszürke spóratömeg borít. A szubsztrát micélium színe nem indikátorkarakterű, és az esetenként termelt világossárga oldódó pigment sem az. A törzs pepton-élesztőkivonat-vas agráron melanoid pigmentet termel, míg tirozin agaron nem képez pigmentet. Az 1. táblázatban a 83-394 jelű Streptomyces törzs rendszertani tulajdonságait összehasonítottuk a korábban leírt Streptomyces galbus törzsek rendszertani jellemzőivel. A fenti rendszertani vizsgálatok adatai szerint a törzs a Streptomyces galbus faj tipikus alakja. A 83-394 jelű Streptomyces galbus törzset 1988. január 20-án letétbe helyeztük Budapesten a Mezőgazdasági és Ipari Mikroorganizmusok Nemzeti Gyűjteményében, ahol az NCAIM B(P) 001036 letéti számot kapta. A fentiek alapján a találmány eljárás az la képletű indanomicin - ahol Rí jelentése metilcsoport - és az Ib képletű homoindanomicin - ahol Rt jelentése etilcsoport - antibiotikumok előáll 1 ítására aerob fermentációval, amely abban áll, hogy a Streptomyces galbus sugárgomba faj NCAIM B(P) 001036 számon letétbe helyezett törzsét vagy annak valamely - indanomicint és/vagy homoindanomicint termelő - mutánsát vagy variánsát szerves nitrogén és szénforrást, valamint ásványi sókat tartalmazó táptalajon 24 és 32 °C közötti hőmérsékleten tenyésztjük, majd a bioszintetizált antibiotikumokat a tenyészetből elkülönítjük és a kívánt esetben egymástól elválasztjuk. A találmány szerinti eljárásban alkalmazott Streptomyces galbus törzs tenyésztésére a sugárgombák tenyésztésére szolgáló általánosan ismert módszereket használhatjuk. Az indanomicin és homoindanomicin antibiotikumokat bioszintetizáló 83-394 jelű treptomyces galbus törzs tenyésztésénél szénforrásként glükóz, keményítő és növényi olajok, nitrogénforrásként szójaliszt, kukoricalekvár, illetve kazein, szervetlen sóként NaCl, K2HPO4 és CaCOs alkalmazható előnyösen. A törzset célszerűen élesztőkivonat-keményítő agaron tartjuk fenn. Ezen a táptalajon a törzs megőrzi termelőképességét háromhavonkénti átoltás esetén. A törzs süllyesztett tenyészetben, 24-32 ‘C közötti hőmérsékleten jó növekedést mutat, az antibiotikum bioszintézis szempontjából előnyös a tenésztést 26-30 *C között végezni. A savas jellegű, erősen lipofil indanomicin és homoindanomicin a fermentlé pH 4,0-4,5-en történő szűrésénél nagyrészt a mikroorganizmus sejtjeihez kötődik és a sejtekről extrakciós módszerekkel nyerhető ki. A szűréskor kapott nedves micéliumról az antibiotikumok előnyösen vízzel elegyedő neutrális, szerves oldószerekkel, pl. alkoholokkal (metilalkohol, etilalkohol, butanol), illetve acetonnal oldhatók le. Az így kapott kivonatot csökkentett nyomáson bepárolva vizes maradékhoz jutunk, melyből vízzel nem elegyedő szerves oldószerrel, előnyösen etilacetáttal extrahálhatjuk az antibiotikumokat. Az etilacetátos extraktum vákuumban történő bepárlásával kapjuk a nyersterméket. Az antibiotikum-komplex tisztítására és komponenseinek egymástól való elvásztasztására oszlop és vékonyréteg-kromatográfiás módszereket alkalmazhatunk. A tisztításnál különösen előnyösen a szilikagél oszlopkromatográfia, eluensként n-hexán-kloroform elegyet, majd kloroformot, végül kloroform-metanol elegyet alkalmazva. Az indanomicin és a homoindanomicin előnyösen elválasztható preparatív vékonyréteg-kromatográfiás módszerrel is, szilikagél G adszorbenst és etilacetátkloroform-metanol (2:1:0,15) arányú oldószerelegyet használva kifejlesztőszerként. Az izolált antibiotikumok szerkezetét az alábbi módon igazoltuk. Az indanomicin fizikai állandói (olvadáspont, optikai forgatóképesség), elemi analízise, valamint spektroszkópiai adatai: ultraibolya-, infravörös-, ' H-NMR-, 13C-NMR és tömegspektrumai egyeztek a szakirodalomban közöltekkel. A homoindanomicin szerkezetét tömegspektroszkópiai vizsgálatokkal állapítottuk meg. Összehasonlítottuk az indadomicinnek, a homoindanomicinnek, valamint diazometánnal végzett észterezéssel előállított metilésztereiknek elektron bombázás hatására végbemenő fragmentációját. A vizsgát 4 vegyület töredezési mechanizmusát az 1. ábra és 2. táblázat mutatja. Az a, b, c, d, e töredék-ionok összevetésével és nagyfelbontású tömegmérésekkel megállapítottuk, hogy a homoindanomicin és az indanomocin rokonszerkezetű vegyületek, melyek abban különböznek egymástól, hogy a kettes helyzetűszénatomhoz az indanomicin esetében metilcsoport, a homoindanomicin esetében pedig etilcsoport kapcsolódik. A tömegspektroszkópiai vizsgálatok alapján meghatározott szerkezettel összhangban van a homoindanomicin ultraibolya, infravörös, *H-NMR és l3C-NMR spektruma. A feltételezett szerkezetet proton- proton korrelációs NMR-vizsgálatokkal is alátámasztottuk. A homoindanomicin és az indanomicin biológiai hatásainak vizsgálatára végzett kísérleteink eredményeit az alábbiakban foglaltuk össze. A homoindanomicin és indanomicin biológiai hatékonysága igen hasonló. A homoindanomicin antibakteriális hatásspektruma egyező az indanomicinével, azaz a Gram szerint pozitívan festődő baktériumok szaporodását igen alacsony koncentrációban meggátolja, de a Gram szerint negatívan festődő baktériumok, továbbá élesztőgombák szaporodására gyakorlatilag hatástalan. A lét antibiotikum antibakteriális spektrumát a 3. táblázat mutatja. A homoindanomicin és az indanomicin ugyanolyan mértékben gátolja a különböző, más típusú hatóanyagok hatásával szemben rezisztens Gram szerint pozitívan festődő mikroorganizmusok szaporodását, mint az érzékenyekét, mert a MIC értékek azonosak más antibiotikumokra és kemoterápiás szerekre érzékeny vagy rezisztens törzsekre egyaránt. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
