200366. lajstromszámú szabadalom • Eljárás módosított higromicin rezisztencia gén előállítására
1 Hü 200366 B 2 coli K12 JA221/pKC307, E. coli K12 JA221/pIT208, E. coli K12 JA221/pIT215, E. coli K12 JA221/pIT217, E. coli K12 JA221/pIT219, E. coli K12 JA221/pIT144 és Saccharomyces cerevisiae/plT208, Saccharomyces cerevisiae/pIT215, Saccharomyces cerevisiae/pIT217 és Saccharomyces cerevisiae/pIT219. A találmány szerinti dezoxi-ribonukleinsavat szelektálható markericént használhatjuk mind homológ (E. coli), mind pedig heterológ (nem-E. coli) rendszerekben, és így lehetővé teszi szelektálható hordozók előállítását gének klónozásához, különböző természetű gazdasejtekben. Az a tény, hogy a találmány szerinti dezoxi-ribonukleinsav rezisztenciát biztosít a higromicin B antibiotikummal szemben, lehetővé teszi a transzformánsok funkcionális vizsgálatát. Ez fontos, mivel szükségünk van a vektor dezoxi-ribonukleinsavat felvett sejtek meghatározására és szelektálására. A vektorokba jelenlétüket funkcionális vizsgálattal ki nem mutatható dezoxi-ribonukleinsav-szegmenseket építhetünk be, és ezután a nem szelektálható dezoxiribonukleinsavat tartalmazó transzformánsokat higromicin B antibiotikummal végzett szelektálással izolálhatjuk. Ilyen, nem szelektálható dezoxi-ribonukleinsav-szegmensek, a felsorolás nem limitáló, a következők: humán inzulin A láncot, humán inzulin B láncot, humán proinzulint, humán-pre-pro-inzulint, humán növekedési hormont, marha növekedési hormont, sertés növekedési hormont, madár növekedési hormont, humán interferont, és nem- humán interferont kódoló szegmensek. Részletesebben, úgy járunk el, hogy egy gént hordozó, nem- szelektálható dezoxi-ribonukleinsavszegmenst beépítünk egy plazmidba, például a pIT144 vagy pIT208 plazmidokba. A nem- szelektálható dezoxi-ribonukleinsavat a pIT144 egyik EcoRI helyébe építhetjük be a pIT144 részleges Sáli emésztését követőén, vagy beépíthetjük a pIT208 Smal helyére. A ligációs eleggyel transzformált sejtek közül az adott rekombinánst telep- hibridizációval azonosítjuk, radioaktív próbát használva. A nem- szelektálható dezoxi-ribonukleinsav jelenlétének bizonyítása után a vektorokat E. coli sejtekben sokszorosítjuk, és ezután, a pIT208 plazmid esetén, élesztő sejtekbe juttatjuk. Az élesztő transzformánsokat higromicin B szelektálással könnyen izolálhatjuk. így az antibiotikum rezisztenciára való szelektálhatóság lehetővé teszi egy adott, nem-szelektálható dezoxi-ribonukleinsavat hordozó, igen ritka sejt hatékony izolálását. A higromicin B rezisztencián alapuló funkcionális vizsgálat elvégezhető olyan dezoxi-ribonukleinsavszegmensek azonosítására is, amelyek gén-kifejeződést szabályozó elemként működnek. Ilyen szegmensek például a promoterek, attenuatorok, represszorok, inducerek, riboszóma kötőhelyek és mások. Ezeket felhasználjuk gazdasági szempontból fontos gének szabályozására. Ezenkívül a találmány szerinti eljárást felhasználhatjuk replikációs origók azonosítására. Ezt úgy végezzük, hogy a találmány szerinti aph(4) gént tartalmazó vektorokba dezoxi-ribonukleinsav-fragmenseket klónozunk, és ezután higromicin B szelekció mellett transzformáljuk az adott gazdasejteket. A higromicin B antibiotikumra rezisztens sejteket szelektáljuk, és a dezoxi- ribonukleinsavukat E. coli sejtekkel transzformáljuk; ezzel izolálhatjuk bármely - számunkra érdekes - mikroorganizmus replikonját. A találmány szerinti rezisztenciát meghatározó vektorokat felhasználhatjuk továbbá annak bizonyítására, hogy a kapcsolt dezoxi-ribonukleinsav-fragmensek stabilan megmaradnak E. coli, élesztő vagy más transzformánsokban. A találmány szerinti aph(4) génhez előnyösen kapcsolt géneket, vagy dezoxi-ribonukleinsav-fragmenseket úgy tartjuk fenn, hogy a transzformánsokat higromicin B jelenlétében emésztjük, a higromicin B koncentrációját úgy választjuk meg, hogy az toxikus legyen a nem-transzformált sejtekre. így a vektort és ezzel a kovalensen kapcsolt dezoxi-ribonukleinsavat elvesztett transzformánsok nem képesek növekedni, és eliminálódnak a tenyészetből. Egy különösen fontos nagyméretű fermentációkor, ahol a terméket maximális hatékonysággal kell kifejeznünk. A találmány szerinti dezoxi-ribonukleinsav, klónozó vektorok és transzformánsok különösen előnyösen használhatók olyan gének klónozására, amelyek közvetve vagy közvetlenül határoznak meg specifikus, funkcionális polipeptideket vagy fúziós géntermékeket, például humán inzulin A láncot, humán inzulin B láncot, humán proinzulint, humán pre-proinzulint, humán növekedési hormont, nem humán növekedési hormont, humán és nem humán interferont és másokat; enzimeket, amelyek gyakorlati szempontból fontos folyamatok vagy vegyületek metabolikus anyagcsere útjában szerepelnek; szabályozó elemeket, amelyek fokozzák gének kifejeződését vagy vektorok replikációját; bármely olyan élettanilag aktív enzimet, amelynek kutatási vagy gyakorlati értéke van. Enzim-funkciót meghatározó dezoxi- ribonukleinsav-szekvenciák például azok a szekvenciák, amelyek cefalosporin antibiotikumok szintézisét, aktaplanin, penicillin, penicillin-származékok, vagy tilozin antibiotikum szintézisét katalizálják. A témában jártas szakember jól érti, hogy a találmány szerinti eljárás széleskörűen használható, és így nem csak a fentiekben ismertetett gének klónozására korlátozódik. A találmány szerinti eljárást a továbbiakban példákkal szemléltetjük. Adott esetben a részletes eljárást, esetenként annak általános leírását ismertetjük. 1. példa A) A kiindulási pKC222 plazmid előállítása A pKC203 plazmid izolálása és az E. coli KI 2 BE827/pKC203 előállítása Az E. coli JR225 (ATCC 31912) baktériumot TY jelű táptalajban (1 % tripton, 0,5 % élesztőkivonat, 0,5 % nátrium-klorid, pH = 7,4) tenyésztjük 100 pg/ml higromicin B antibiotikum jelenlétében, közismert mikrobiológiai módszereket használva. 18 órás tenyésztés után 0,5 ml tenyészetet 1,5 ml térfogatú Eppendorf csőbe helyezünk, és 15 mp-en át centrifugáljuk. Ha másként nem adjuk meg, az összes lépést szobahőmérsékleten végezzük. A felülúszót óvatosan, vékonyra kihúzott végű pipettával eltávolítjuk, és az üledéket 100 pl frissen készített lizozim- oldatban szuszpendáljuk. Ennek összetétele a következő: 2 pg/ml lizozim, 50 mmól glükóz, 10 mmól CDTA (ciklohexán-diamin-tetraecetsav), 25 mmól trisz-hidrogén-klorid (pH = 8,0). 30 percen át 0 *C hőmérsékleten inkubáljuk a szuszpenziót, és ezután 200 pl alkalikus nátrium-do-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 9
