200366. lajstromszámú szabadalom • Eljárás módosított higromicin rezisztencia gén előállítására
1 HU 200366 B 2 decil-szulfát-oldatot adagolunk (0,2 n nátrium-hidroxid, 1 % nátrium-dodecil-szulfát). Enyhén keveijük a centrifugacsöveket, és 0 ”C hőmérsékleten tartjuk 15 percen át Ezután 150 ml 3 mólos nátrium-acetátoldatot adagolunk, amit úgy állítunk elő, hogy 3 mól nátrium- acetátot adunk a lehető legkevesebb mennyiségű vízhez, az oldat pH-ját jégecettel 4,8-re állítjuk be, ezután pedig 1,0 1-re állítjuk be a térfogatot. A centrifugacsövet enyhén rázogatva néhány percen át keveijük az oldatot, ezalatt dezoxi- ribonukleinsav-csapadék képződik. 60 percen át 0 'C hőmérsékleten tartjuk az oldatot, ezután 5 percen át centrifugáljuk, amiután majdnem teljesen tiszta felülúszót kapunk. 0,4 ml felülúszót egy másik centrifugacsőbe töltünk, a csőbe előzőleg 1 ml hideg etanolt mértünk. 30 percen át -20 °C hőmérsékleten tarjuk az elegyet, majd a csapadékot centrifugálással összegyűjtjük. A centrifugálást 2 percen át végezzük. A felülúszót eltávolítjuk. Az így kapott csapadékot 100 pl 0,1 mól nátrium-acetát/0,05 mól trisz-hidrogén-klorid (pH = 8,0) elegyben oldjuk, és 2 térfogat hideg etanol adagolása után újra kicsapjuk. 10 percen át 20 “C hőmérsékleten tartjuk a szuszpenziót, majd ezután centrifugálással elkülönítjük az E. coli JR225 plazmid dezoxi-ribonukleinsav-csapadékot. Az E. coli JR225 plazmid dezoxi-ribonukleinsavból álló üledéket 40 pl vízben vagy híg pufferban oldjuk, és E. coli K12 BE827 sejteket transzformálunk, lényegében Wensink módszere szerint eljárva [Cell, 3, 315 (1974)]. Az E. coli K12 BE827 jelű törzs az American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA, törzsgyűjteményében található, ATCC 31911 sorszámon. A kapott transzformánsokat TY agaron szelektáljuk. Az agar összetétele a következő: 1 % tripton, 0,5 % élesztőkivonat, 0,5 % nátrium-klorid, 1,5 % agar, pH = 7,4, 200 pg/ml higromicin B antibiotikum. A gélelektroforetikus vizsgálat [Rao és Rogers, Gene, 3, 247 (1978)] szerint egyes transzformánsok nagy és kisebb (15 kB) nagyságú plazmidokat tartalmaznak, és rezisztensek ampicillin és higromicin B antibiotikumokra. Egyes transzformánsok csak a kisebb, 15 kB nagyságú plazmidot tartalmazzák, és rezisztensek higromicin B és G418 antibiotikumokra, de érzékenyek ampicillinre. Ez utóbbi típusú transzformánsokat 1 mg/ml higromicin B antibiotikumot tartalmazó TY agaron szélesztjük, és standard mikrobiológiai technikákat alkalmazva tenyésztjük. A kapott sejteket felhasználjuk a fent leírt 15 kB nagyságú, higromicin B és G418 antibiotikumokkal szembeni rezisztenciát meghatározó plazmid izolálására, a plazmidot ezután pKC203 jellel adjuk meg. A pKC203 plazmidban jelenlevő higromicin B és G418 antibiotikumokkal szembeni rezisztenciát biztosító gének létét ezután transzformációval és szelekciós analízissel bizonyítjuk. B) A pKC222 plazmid előállítása és az E. coli KI2 JA22l'pKC222 törzs izolálása 1) A pKC203 plazmid 2,75 kB nagyságú Sall/BgUI fragmensének izolálása 5 pg pKC203 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat Sáli és Bgin restrikciós enzimekkel kezelünk, a gyártó előírásai szerin t eljárva [A restrikciós enzimeket, a T4 dezoxi-ribonukleinsav- ligázt, a dezoxiribonukleinsav polimerázt és a Klenow-fragmenst az alábbi forrásból szereztük be: New England Biolabs., 32 Tozer Road, Beverly, MA 01915, USA]. A restrikciós enzimek használatára vonatkozóan lásd Maniatis és munkatársai közleményét is. [Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982)]. Ismert módon [Maniatis és munkatársai (1982), lásd előbb] izolálunk egy 2,75 kb nagyságú fragmenst, amely tartalmaz géneket és szabályozó elemeket a higromicin B és a G418 antibiotikumokkal szembeni rezisztencia kifejezésére. 2) Ligálás és a végtermék előállítása 5 pg pKC7 (ATCC 37084) plazmidot kezelünk Sáli és Bgin restrikciós enzimekkel. A plazmidot Rao és Rogers szerint állíthatjuk elő [Gene, 7, 79 (1979)]. Az enzimek inaktiválására 5 percen át 70 °C hőmérsékleten tartjuk az elegyet, majd 1 pg dezoxi-ribonukleinsavat keverünk 1 : 1 arányban a pKC203 plazmid 2,75 kB nagyságú Sall/BgUI fragmensével. A fragmenseket T4 dezoxi-ribonukleinsavligázzal összekapcsoljuk, a gyártó cég előírásai szerint eljárva [lásd 1. példa B-l) pontját], A fentiekben megadott restrikciós enzimek használata kapcsán lásd továbbá Maniatis és munkatársai közleményét (1982, mint előbb). A kapott pKC222 plazmidot E. coli K12 JA221 sejtekbe (NRRL B-15211) transzformáljuk, az 1. példa A) pontja szerint eljárva. A kapott tamszformánsokat az alábbi összetételű, TY jelű agaron szelektáljuk: 1 % tripton, 0,5 % élesztőkivonat, 0,5 % nátrium-klorid, 1,5 % agar, 50 pg/ml ampicillin antibiotikum. A transzformánsokat az előállított plazmid jelenléte szempontjából vizsgáljuk. 3) A pKC222 plazmid izolálása A tisztított transzformánsokat TY táptalajon tenyésztjük (1 % tripton, 0,5 % élesztőkivonat, 0,5 % nátrium-klorid, pH = 7,4, 50 pg/ml ampicillin antibiotikum). A tenyésztést ismert mikrobiológiai módszereket használva végezzük. 18 órás tenyésztést követően 0,5 ml tenyészetet 1,5 ml Eppendorf centrifugacsőbe pipettázunk, és 15 másodpercen át centrifugáljuk. Ha másként nem adjuk meg, az összes kísérleti lépést szobahőmérsékleten végezzük. A kapott felülúszót óvatosan eltávolítjuk, és a sejtszuszpenziót 100 pl frissen készített lizozim-oldatban szuszpendáljuk. Ennek összetétele a következő: 2 pg/ml lizozim, 50 mmól glükóz, 10 mmól ciklohexán-diamin-tetraecetsav és 25 mmól trisz-hidrogén-klorid, pH = 8,0. 30 percen át 0 °C hőmérsékleten inkubálunk, és ezután 200 pl alábbi összetételű alkalikus nátriumdodecil-szulfát-oldatot adagolunk: 0,2 n nátrium-hidroxid, 1 % nátrium-dodecil-szulfát. Enyhén keverjük a centrifugacsöveket, és 15 percen át 0 °C hőmérsékleten tartjuk. Ezután 150 pl 3 mólos 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 10
