200366. lajstromszámú szabadalom • Eljárás módosított higromicin rezisztencia gén előállítására
1 HU 200366 B 2 meghatározó kódoló szekvenciából áll, ami fuzionált a csonka aph(4)-génnel. Az előállított gént tartalmazó, pIT144 jellel jelzett plazmid restrikciós térképét a mellékelt 2. ábrán adjuk meg. Előállítottunk egy hasonló plazmidot, ezt pKC307 jellel jelöljük, oly módon, hogy a pIT104 plazmid tompa végű Hphl ffagmensét ligáltuk a pUC8 plazmid Hindi enzimmel emésztett tompa végű fragmenséhez. Az utóbbi plazmid hasonló a pUC7 plazmidhoz, és könnyen hozzáférhető, illetve előállítható Vieira és Messing, 1982 (lásd előbb) módszere szerint. A találmány szerinti dezoxi-ribonukleinsav kapcsolható eukariota génekkel vagy gén-részekkel is, így például az élesztő hősokk génjével (YG101), amit Ingolia és munkatársai közölnek [Mól. and Cellular Bioi., 2, 1388 (1982)]. Az YG101 transzkripciós és transzlációs aktivációs szekvenciájának mobilizálhatósága a pIT118 plazmid 750 bázispár nagyságú BamHI-BglII fragmensén különösen előnyössé teszi a fúziót Úgy járunk el, hogy először előállítjuk a pIT207 plazmidot, ez egy köztes plazmid, tartalmazza az előzőekben ismertetett transzkripciós és transzlációs aktivációs szekvenciát tartalmazó fragmenst a pMC1587 plazmid BamHI helyébe építve. A pIT123 plazmid 1,3 kb nagyságú BamHI-BglII fragmensét a pIT207 plazmid BamHI helyébe ligáivá pIT208 jellel jelzett bifunkcionális plazmidhoz jutunk. A pIT208 plazmid szelektálható E. coli sejtekben, rezisztenciát határoz meg higromicin B antibiotikummal szemben élesztőben, és így szemlélteti a találmány szerinti eljárást A pIT208 plazmid restrikciós térképét a mellékelt 3. ábrán adjuk meg. Az YG100 jelű hősokk gént [Ingolia és munkatársai (1982), lásd előbb] hasonlóképpen használhatjuk előnyös transzlációs fúziók előállítására. Úgy járunk el, hogy a pIT120 plazmid transzkripciós és transzlációs aktivációs szekvenciát tartalmazó 1 kb nagyságú BamHI-BglII fragmensét ligáljuk a BamHI enzimmel emésztett pIT213 plazmidba. Az utóbbi plazmid tartalmazza az ismert pRB5 plazmidot, egy kanamicin rezisztenciát meghatározó gént, és a fenti, csonka higromicin B rezisztencia gént tartalmazó 1,3 kb nagyságú, pIT123 plazmidból származó BamHI- BglII fragmenst. A hsclOO transzkripciós és transzlációs aktivációs szekvencia forrása a pIT120 plazmid könnyen izolálható az E. coli K12 JA221/pIT120 sejtekből. A törzset a Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois, USA, állandó törzsgyűjteményében találhatjuk. A törzs a plazmid forrásaként használható, és NRRL B-15603 sorszámon rendelhető meg. A pIT120 és a pIT213 fragmensek fentiekben ismertetett ligációját követően bifunkcionális, pIT217 jellel jelzett plazmidot kapunk. A pIT217 plazmid E. coli sejtekben szelektálható, higromicin B antibiotikummal szembeni rezisztenciát biztosít élesztőben, és így a találmány szerinti eljárást tovább szemlélteti. A témában jártas szakember tudja, hogy a BamHI enzimmel emésztett pIT213 flagmens és a pITl 18 plazmid 750 bázispárból álló BamHI- BglII fragmense ligációt követően szintén hasonló fúziós terméket eredményez, amely a találmány oltalmi köréhez tartozik. A kapott, pIT215 jellel jelzett plazmid E. coli sejtekben szelektálható, és higromicin B antibiotikummal szembeni rezisztenciát biztosít élesztőben. Előállíthatunk más termékeket is, különböző géneket használva. így például az eukariota foszfo-glicerát kináz gén (PGK) kapcsolható a találmány szerinti csonka higromicin B rezisztenciát kódoló dezoxi-ribonukleinsavval úgy, hogy a pIT143 plazmid transzkripciós és transzlációs aktivációs szekvenciát tartalmazó 230 bázispárból álló BamHI fragmensét kapcsoljuk a pIT213 plazmid BamHI fragmensével. A pIT143 plazmidból izoláljuk a PGK transzkripciós és transzlációs aktivációs szekvenciát, a plazmidot úgy állítjuk elő, hogy a pIT141 plazmid 958 bázispárból álló Clal-HincII fragmensét MboII restrikciós enzimmel kezeljük, a képződött egyszálú szakaszt a dezoxi-ribonukleinsav-polimeráz Klenow-fragmensével eltávolítjuk, TGGATCCA szekvenciájú BamHI linkereket kapcsolunk, és a linkért tartalmazó fragmenst ligáljuk a pUC8 BamHI enzimmel kapott fragmenséhez. A pIT141 plazmid tartalmazza a teljes PGK gént, a plazmidot felhasználjuk a pIT143 plazmid előállítására. A pIT141 plazmid könnyen izolálható az E. coli K12 JA221/pIT141 sejtekből, a törzset a Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois, USA, törzsgyűjteményében találjuk. A törzset a plazmid forrásaként NRRL B-15602 sorszámon rendelhetjük meg. A témában jártas szakember felismeri, hogy nagyszámú gén, vagy gén-rész helyettesíthető a szemléltető jelleggel bemutatott bakteriális lacZ és eukariota PGK, YG100 és YG101 génekkel. A gének vagy génrészek által meghatározott aminosavak számát a találmány szerinti eljárás alkalmazásakor nem tarjuk lényegesnek. Génként használhatunk például 1) E. coli géneket, például trpE vagy lipoprotein gént; 2) Saccharomyces cerevisiae géneket, például az a-faktor gént; 3) Bacillus géneket, például az a-amiláz gént vagy az spoVG gént; 4) Streptomyces gént, például a tiosztrepton rezisztencia, a neomicin rezisztencia vagy a viomicin rezisztencia gént; 5) vírus vagy bakteriofág géneket, például a lambdaPL, vagy a lambdaPR promoterek által leírt géneket; 6) emlős géneket, például a timidin kinázt vagy a dihidro-folát reduktáz gént; továbbá 7) növényi géneket, például az oktopin szintetáz, vagy a nopalin szintetáz géneket. A fenti géneket megfelelő restrikciós enzimmel és/vagy Bal31 nukleázzal való kezeléssel rövidíthetjük, majd ezután az adódó lehetőségektől, és a kívánt fúziótól függően molekuláris linkerekkel egészítjük ki. A molekuláris linkereket a piacról beszerezhetjük, vagy, ha speciális vagy szokatlan génfúziót kell végeznünk, Itakura és munkatársai módszere szerint előállíthatjuk [Itakura és munkatársai (1977), lásd előbb; Crea és munkatársai (1978), lásd előbb]. Különösen előnyös fúziót eredményez az az eljárás, amikor a pIT123 plazmid aph(4) gént tartalmazó fragmensét a pIA7A4Al plazmid 4,5 kb nagyságú BamHI-BglII fragmenséhez ligáljuk. Az utóbbi fragmens tartalmazza a transzkripciós és transzlációs aktivációs szekvenciát, és tartalmazza továbbá a bakteriális trp LE’ gén 15 aminosavból álló kódoló szakaszát Ennek a ligálásnak az eredményeképpen megkapjuk az 5,8 kb nagyságú pIT125 plazmidot 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
