200366. lajstromszámú szabadalom • Eljárás módosított higromicin rezisztencia gén előállítására
1 HU 200366 B 2 ahol A dezoxi-adenil-, G dezoxi-guanidil-, C dezoxi-citizil-, T timidilcsoport, R és R2 lizint meghatározó dezoxi-ríbonukleotid triplettek, egymástól függetlenül, R1 és R3 olyan dezoxi-ríbonukleotid triplettek, amelyekben a nitrogén-tartalmú bázis komplementer a megfelelő R és R2 bázissal, m és n 0 vagy 1, azzal a kikötéssel, hogy ha n = 0, úgy m = 0, és, ha m = 1, úgy n = 1, R4 transzlációs stop kodont meghatározó dezoxiríbonukleotid triple«, és R5 olyan dezoxi-ríbonukleotid triple«, amelyben a nitrogén-tartalmú bázis komplementer a megfelelő R4 bázissal. A fenti dezoxi-ribonukleinsav által meghatározó« aminosavakat az alábbi jelentésű rövidítésekkel jelöltük: MET = metionin, LYS = lizin, PRO = prolin, GLU = glutaminsav, LEU = leucin, THR = «eonin, ALA = alanin, SER = szerin, VAL = valin, PHE = fenil-alanin, ILE = izoleucin, GLY = glicin, ASP = aszparaginsav, GLN = glutamin, ARG = arginin, CYS = cisztein, TRP = triptofán, ASN = aszparagin, HIS = hisztidin és TYR = tirozin. A találmány szerinti dezoxi-ribonukleinsavakat, amelyekben R, R1, R2, R3, R4 és R5 a genetikai kódnak megfelelőek (Watson, J.D., Molecular, Biology of the Gene, W.A. Benjamin Inc., Menlo Park, California, 1976), ismert módon szintetizálhatók a módosított foszfo-triészter-módszerrel, teljesen védett tridezoxiribonukleotid építőkövekből. Ilyen szintetikus módszerek jól ismertek az irodalomból, és az alábbi szerzők szerint kivitelezhetek: Itakura és munkatársai, Science, 198, 1056 (1977), Crea és munkatársai, Proc. Nat. Acad. Sei., USA, 75, 5765 (1978). A témában jártas szakemberek tudják, hogy a fentiek során ismertetett dezoxi-ribonukleinsav-szekvencia által meghatározott aminosavak más dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciákkal is előállíthatók. Ezek a dezoxiribonukleinsav-szekvenciák a genetikai kód degeneráltsága miatt használhatók, így a találmány oltalmi körén belül esnek. A pKC222 plazmid megfelelő emésztésével előállítható az a fentiekben megadott dezoxi-ribonukleinsav-molekula, ahol m = 0, R4 TAG és R5 ATC. A pKC222 plazmidban a higromicin B foszfotranszferáz gén kódoló szakaszának kezdetén levő Hphl restrikciós hely erre a célra igen alkalmas. így a HphI-PstI emésztést követően a pKC222 plazmidból higromicin B foszfotranszferáz génhez jutunk, ez 325 bázispárból áll (továbbá az egyszálú végből), és amely meghatározza a higromicin B foszfotranszferáz polipeptid 4-112. aminosavát. A Hphl restrikciós enzimmel lehasítjuk a baloldali rész 3’-egyszálú szakaszát, majd a fragmenshez BamHI molekuláris linkért kapcsolunk, EcoRI restrikciós enzimmel hasítjuk, és ezután hozzákötjük a pBR322 plazmid BamHIEcoRI emésztett fragmenséhez. A kapott plazmidot pIT122 jellel jelöljük, ez a higromicin B foszfotranszferáz gén egy részét tartalmazza, és kiindulási anyagként használható fel. A higromicin B foszfotranszferáz enzim 113-341. aminosavát meghatározó genetikai információt a pKC222 plazmid 1,45 kb nagyságú EcoRI fragmenséből nyerjük, amit a megfelelően hasított pIT122 plazmidba építünk be. A kapott plazmidot pIT123 jellel jelöljük, ez tartalmazza a higromicin B foszfotranszferáz strukturgén teljes szakaszát, kivéve az első 9 nukleotidpárt, ahola BamHI linker fekszik. Az előállított gén így olyan higromicin B foszfotranszferázt ír le, amely a természetes gén által meghatározott polipeptidhez képest az első 3 aminosavat elvesztette. A pIT123 plazmid restrikciós térképét a mellékelt 1. ábrán adjuk meg. A találmány szerinti dezoxi-ribonukleinsavat a pKC222 plazmidból nyeljük, a plazmid 6,8 kb nagyságú, és úgy állítjuk elő, hogy a pKC203 plazmid 2,75 kb nagyságú Sall-Bgin fragmensét ligáljuk a pKC7 plazmid 4,1 kb nagyságú Sall-BglII fragmenséhez. A pKC203 plazmid 15 kb nagyságú és könnyen izolálható az E. coli- JR225 törzsből, amelyet az American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA törzsgyűjteményében megtalálhatunk. A törzs a pKC203 plazmid forrásaként rendelhető meg ATCC 31912. sorszámmal. A pKC7 plazmid ismert az irodalomból (ATCC 37084.), Rao és Rogers módszere szerint előállítható [Gene, 7, 79 (1979)]. A pKC222 és a pKC203 plazmidok restrikciós térképét az 1. és 2. ábrán ismertetjük. A találmány szerinti dezoxi-ribonukleinsavat domináns, szelektálható markéiként használhatjuk fel akkor, ha transzlációs szempontból leolvasási fázisban kapcsoljuk egy transzkripciós és transzlációs aktivációs szekvenciát tartalmazó génhez, vagy a gén egy részéhez. A gén vagy a gén-rész által kódolt aminosavak száma a találmány szerinti eljárásban nem lényeges. Egy baktériumgén esetén a fúziót úgy végezzük el, hogy a nem-teljes aph(4) pIT123 plazmid gént kapcsoljuk a pUC7 plazmidba. A pUC7 plazmid könnyen hozzáférhető és előállítható Vieira és Messing, Gene, 9, 259 (1982) szerint, a plazmid tartalmazza az E. coli lac Z gén egy részét, és tartalmaz egyetlen BamHI restrikciós helyet jobbra haladva a lac operátortól és transzlációs iniciációs jelektől. A BamHI helynél a lac Z génfragmens leolvasási fázisa megfelel a pIT123 plazmid csonka aph(4) génjének leolvasási fázisával. így ha a két gént a BamHI helyen összekapcsoljuk úgy, hogy a pIT123 plazmid 1,3 kb nagyságú BamHI-Bgin fragmensét ligáljuk a pUC7 plazmid BamHI helyébe, olyan hibrid gént kapunk, amely higromicin B-vel szembeni rezisztenciát határoz meg. A fenti, szemléltető jelleggel bemutatott készítmény a lac Z gén első 20 aminosavát 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
