200366. lajstromszámú szabadalom • Eljárás módosított higromicin rezisztencia gén előállítására
1 HU 200366 B 2 közel. Az LE’ (d) fragmenst a pSOM7A2 plazmid BglII helyébe klónozhatjuk, amikor a triptofán promoter/operátor rendszer szabályozása alatt kifejeződd LE’ polipeptid-szomatosztatin fúziós protein kapunk. Először a pSOM7A2 plazmidot EcoRI enzimmel részlegesen emésztjük a triptofán promoter/operátor rendszertől távolabb eső EcoRI hely hasítására, ezután a megfelelő primer szekvenciát kiválasztjuk a kodon leolvasási sémájának megfelelő megtartása érdekében, és egy EcoRI hasítási hely visszaállítására. 16 jig pSOM7A2 plazmidot 200 pl, 20 mmól triszt, pH = 7,5, 5 mmól magnézium-kloridot, 0,02 % NP40 detergenst és 100 mmól nátrium- kloridot tartalmazó pufferban oldunk, az oldathoz 0,5 egység EcoRI enzimet adunk. 15 percen át 37 °c hőmérsékleten inkubáljuk az elegyet, majd ezután fenollal, ezt követően kloroformmal extraháljuk, etanollal kicsapjuk, és a terméket BglE enzimmel emésztjük. A nagyobb fragmenst poliakril-amid gél- elektroforézissel választjuk el és elektro-elúcióval izoláljuk. A fragmens tartalmazza az LE’ polipeptid proximális végének un. "LE’ (p)" kodonjait, azaz a BglII helytől jobbraeső részt. Ezt a fragmenst az előzőek szerint előállított LE’ (d) fragmenshez kapcsoljuk T4 dezoxi-ribonukleinsav ligázzal, amikor megkapjuk a pSOM7A2A4 plazmidot. A plazmiddal E. coli 294 sejteket transzformálva olyan fúziós proteint termelő törzseket kapunk, amely fúziós protein tartalmazza a teljes LE polipeptidet és a szomatosztatint, mégpedig a triptofán promoter/operátor rendszer szabályozása alatt kifejezhetően. F) Tetrad ki in rezisztendát meghatározó gént tartalmazó lineáris dezoxi-ribonukleisav előállítása, amely 3’-végén egy PstI szakaszt és 5’-végén egy BglII szakaszt hordoz A pBR322 plazmidot Hindin enzimmel hasítjuk, és a Hindin végeket SÍ nukleázzal emésztjük. Az SÍ nukleázos kezelést úgy végezzük, hogy 10 pg HindlII enzimmel hasított pBR322 dezoxi- ribonukleinsavat 30 pl SÍ-pufferban 300 egység SÍ nukleázzal kezelünk 30 percen át 15 °C hőmérsékleten. Az SI-puffer az alábbi összetételű: 0,3 mól nátrium-klorid, 1 mmól cink-klorid, 25 mmól nátrium-acetát, PH = 4,5. A reakció leállítására 1 pl 30X S1 nukleázt leállító oldatot adagolunk. Ennek összetétele a következő: 0,8 mól trisz-bázis, 50 mmól etilén-diamintetraecetsav. Az elegyet fenollal, majd kloroformmal extraháljuk, etanollal kicsapjuk, és EcoRI enzimmel hasítjuk a terméket. Poliakril-amid gél-elektroforézissel és elektro-elúcióval izoláljuk a fragmenst, ez EcoRI ragadós véggel és egy tompa véggel rendelkezik, kódoló szála pedig egy timin nukleotiddal kezdődik. A timidinnel kezdődő SÍ enzimmel emésztett HindlII szakaszt Klenow polimeráz I enzimmel kezelt Bgin szakaszhoz kapcsolható úgy, hogy ligációt követően újra létrejön a BglII restrikciós hely. A 7. példa IC) pontjában előállított pSOM7A2 plazmidot BglII enzimmel emésztjük, és a BglII ragadós végeket kétszálúvá alakítjuk Klenow polimeráz I enzimmel a 4 dezoxi-nukleotid- trifoszfát jelenlétében. A kapott dezoxi-ribonukleinsavat EcoRI enzimmel hasítjuk, majd ezután a kis fragmenst poliakril-amid gél-elektroforézissel és elektro-elúcióval izoláljuk. A kapott lineáris dezoxi-ribonukleinsav fragmens tartalmazza a triptofán promoter/operátor rendszert és a BglH helytől jobbraeső LE’ "proximális" szekvenciát ["LE’ (p)"]. A termék EcoRI véggel, és egy tompa véggel rendelkezik, ez a Bgin hely feltöltése után jött létre. A BgUI hely újra létrejön, amikor a tompa véget kapcsoljuk a fentiek szerint előállított SÍ-emésztett Hindin fragmens tompa végével. A két fragmenst T4 dezoxi-ribonukleinsav ligázzal kapcsoljuk össze, ezután megkapjuk a körré zárt pHKYlO plazmidot. Ezt a plazmidot E. coli 294 sejtekbe transzformáljuk. A tetraciklinre rezisztens sejtek hordozzák a pHKYlO rekombináns plazmidot, a sejteket szelektáljuk, és a plazmid dezoxi- ribonukleinsavat izoláljuk. A terméket BglH és PstI enzimekkel emésztjük, a dezoxi-ribonukleinsavat poliakril-amid gél- elektroforézissel és a nagyobb fragmens elektro-elúciójával izoláljuk, így megkapjuk azt a lineáris dezoxi-ribonukleinsavat, amelynek PstI és BgUI ragadós végei vannak. A pHKYlO plazmidból kapott dezoxi-ribonukleinsav tartalmazza a replikációs origót, és így felhasználható a pLA7A4Al plazmid előállítására, amelyben mind a trp LE’ polipeptid fúziós proteinjének génje, mind pedig a tetraciklin rezisztenciát meghatározó gén a trp promoter/operátor szakasz szabályozása alatt áll. G) A trp promoter/operátor rendszert tartalmazó lineáris dezoxi- ribonukleinsav előállítása A 7. példa IC) pontjában előállított pSOM7A2A4 plazmidot EcoRI, majd PstI enzimmel kezeljük. A kapott fragmens tartalmazza a trp promoter/operátor szakaszt, ezt poliakril-amid gél- eiektroforézist követő elektro-elúcióval izoláljuk. Részleges EcoRI emésztés szükséges ahhoz, hogy megkapjuk azt a fragmenst, amely a szomatosztatin gén 5’-végének közelében hasadt, ugyanakkor azonban nem hasadt az az EcoRI hely, amely az ampicillin rezisztencia gén és a trp promoter/operátor között helyezkedik el. A PstI enzimmel való emésztés miatt elvesztett ampicillin rezisztencia visszaállítható a 7. példa 1F) pontja szerint előállított pHKYlO plazmid lineáris származékával kivitelezett ligációs reakcióval. H) Az inzulin A lánc strukturgénjének izolálása Az inzulin A lánc strukturgénjét a pIAl plazmid EcoRI és BamHI emésztésével állítjuk elő [lásd Goeddel és munkatársai, PNAS, USA, 76, 106 (1979)]. A plazmid előállítható az E. coli K12 94/pIAl (ATCC 31448) törzsből is. Az adott fragmenst poliakril- amid gél-elektroforézissel és elektro-elúcióval izoláljuk, a termék EcoRI és BamHI végekkel rendelkezik. I) Az inzulin A lánc strukturgénjének, a trp promoter/operátor szakasznak és a PstI és BglII végekkel rendelkező pHKYlO lineáris dezoxi-ribonukleinsav fragmens ligálása Az inzulin A lánc strukturgénjét, a trp promoter/operátor rendszert tartalmazó, a 7. példa 1G) pontjában előállított lineáris dezoxi-ribonukleinsav fragmenst és a 7. példa 1F) pontjában megadottak szerint kapott lineáris pHKYlO dezoxi- ribonukleinsav fragmenst megfelelő orientációban Egáljuk, ahogy azt a 8. ábrán megadjuk. így megkapjuk a pIA7A4Al plazmidot. Ez a plazmid könnyen szelektálható, mivel visszaáll az ampicillin és tetraciklin rezisztenciát meghatározó szekvencia. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 18
