200366. lajstromszámú szabadalom • Eljárás módosított higromicin rezisztencia gén előállítására
1 HU 200366 B 2 2) A plT123 plazmid 1,3 kb nagyságú BamHIIBgUI és a pIA7A4Al plazmid 4$ kb nagyságú BamHUBglll fragmensének ligálása A) A pIA7D4DI plazmid emésztése BamHUBglll enzimmel és a 4J kb nagyságú fragmens izolálása Az emésztést és az izolálást a 2. példa A) pontjában megadottak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy a pIT123 plazmid és a Hphl, illetve PstI restrikciós enzimek és reakcióelegyek helyett a pIA7A4Al plazmidot, és a BglII, illetve a BamHI restrikciós enzimet, és az ezekhez tartozó, az eladó cég által megadott reakcióelegyeket használjuk. B) Ligálás és transzformálás A ligációt és transzformációt a 3. példa C) pontjában megadottak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy a pUC7 plazmid és a E. coli K12 RR1AM15 sejtek helyett a pIA7A4Al plazmid 4,5 kb nagyságú BamHI/Bgin fragmensét és az E. coli K12 JA221 (NRRL B- 15211) törzset használjuk. A transzformált sejteket 50 pg/ml ampicillint tartalmazó TY szilárd halmazállapotú táptalajra szélesztjük, majd 5 200 pg/ml higromicin B antibiotikumot tartalmazó táptalajra replikázzuk. A higromicin B antibiotikumra rezisztens E. coli K12 JA221/pIT125 transzformánsokat a pIT125 plazmid előállítására és izolálására ismert módon tenyésztjük. A pIT125 plazmiddal is- 10 mert módon transzformálhatok E. coli törzsek, mint például az E. coli K12, E. coli K12 RR1 vagy az E. coli K12 HB101. A transzformációkat a 2. példa B) pontjában megadottak szerint végezzük. A pIT125 plazmid restrikciós térképét a mellékelt 4. ábrán 15 adjuk meg. Az előzőekben megadottak szerint előállítható további, szemléltetés érdekében megadott plazmidokat és transzformánsokat ismertetünk a II. és Hl. táblázatban. H. Táblázat A találmányt szemléltető plazmidok Példa száma Név Nagyság kb-ban Genetikai jelzés E. coli élesztő Előállítás 8. pIT143 3,0 Ap1* A pIT141 plazmid 958 bázis pár hosszúságú Clal/HincII fragmensének MboH emésztése, majd a túlnyúló szakaszok eltávolítása, TGGATCCA szekvenciájú BamHI linker kapcsolása és beépítés a BamHI enzimmel emésztett pUC8 plazmidba 9. pIT212 8,9 Ap1* URA3 A pIT103 plazmid 1,3 kb nagyságú BamHI/BglII fragmensének ligálása a pRB5 BamHI emésztéssel kapott fragmenséhez (ATCC 37051) 10. pIT213 10,6 ApR KmR URA3 A pNG59x plazmid 1,7 kb nagyságú PvuII fragmensének ligálása az Smal enzimmel emésztett pIT212 plazmidba 11. pIT215 11.4 Ap1* URA3 A pITl 18 750 bázispár nagyságú BamHI/BglII fragmensének kapcsolása a pIT213 plazmid BamHI fragmenséhez, a kapcsolás a 8. ábrán megadott orientációban történik 12. pIT217 11,7 Ap11 KmR URA3 HmR A pIT120 1 kb nagyságú BamHI/Bgin fragmensének kapcsolása a 8. ábrán megadott orientációban a pIT2l3 plazmid BamHI lineáris fragmenséhez 13. pIT219 10,8 Apr URA3 A pIT143 plazmid 230 bázispár hosszúságú BamHI fragmensének kapcsolása a 9. ábrán megadott orientációban, a pIT213 plazmid BamHI fragmenséhez * = A pNG59 plazmid előállítására és izolálására az E. coli KI2 RRl/pNG59 törzset tenyésztjük. A törzset a Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois, állandó törszgyújteményében találjuk NRRL B-15604 sorszámon. IH. Táblázat A találmány szerinti transzformánsok E. coli/R E. coli K12/R E. coli K12 JA221/R E. coli K12 HB101/R E. coli K12 RR1/R Saccharomyces cerevisiae/R1, ahol R jelentése a következő: pIT143, pIT212, pIT213, plT215, pIT217 vagy pIT219, továbbá, ahol R1 pIT212, pIT213, pIT215, pIT217 vagy pIT219 plazmid. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 55 1. Eljárás a higromicin B foszfotranszamináz enzim utolsó 338 aminosavát meghatározó dezoxi-ribo nukleinsav szekvenciát önmagában, vagy leolvasási fázisban egy transzkripciós és transzlációs aktivációs szekvenciát tartalmazó génnel együtt tartal- 60 mazó plazmid előállítására, azzal jellemezve, hogy a) a pIT123 plazmid előállítására pKC222 plazmid 1,45 kb nagyságú EcoRI restrikciós fragmensét ligáljuk az ÉcoRI restrikciós enzimmel emésztett 65 pIT122 plazmiddal, majd kívánt esetben 19
