200366. lajstromszámú szabadalom • Eljárás módosított higromicin rezisztencia gén előállítására
1 HU 200366 B 2 6, 3267-3287 (1979), továbbá West és munkatársai. Gene, 7, 271-288, (1979)] ampicillin rezisztenciát fejez ki, és tartalmaz egy tetraciklin rezisztencia gént, azonban nem kapcsolódik ehhez promoter, és így a rezisztenciát nem fejezi ki. A plazmidot tartalmazó törzset az American Type Culture Collection állandó törzsgyűjteményében ATCC 37070 sorszámon helyeztük letétbe. így a plazmidot tartalmazó sejtek tetraciklinre érzékenyek. Ha az EcoRI helyre egy promoter/operátor rendszert építünk be, úgy a plazmid tetraciklin rezisztenciát fog meghatározni. A pBRHl (ATCC 37070) plazmidot EcoRI enzimmel hasítjuk. Az enzimet fenolos, majd ezt követó kloroformos extrakcióval távolítjuk el, és a dezoxiribonukleinsavat etanolos kicsapás után vízben oldjuk. A kapott dezoxi-ribonukleinsav molekulát külön-külön elkészített reakcióelegyekben a 7. példa A) pontjában előállított 3 dezoxi-ribonukleinsav-fragmenssel kapcsoljuk T4 dezoxi-ribonukleinsav ligázt használva. A reakcióelegyben levő dezoxi-ribonukleinsavval kompetens E. coli KI2 294 törzset transzformálunk [Backman és munkatársai, PNAS, USA, 73, 4174-4198 (1976), ATCC 31446]. A transzformálást ismert módon végezzük (lásd Hershfield és munkatársai, PNAS, USA, 71, 3455-3459 (1974)). A baktériumokat LB (lásd előbb) táptalajra szélesztjük, a táptalaj 20 pg/ml ampicíllint és 5 pg/ml tetraciklint tartalmaz. Több tetraciklinre rezisztens telepet szelektálunk, és izoláljuk belőlük a plazmid dezoxi-ribonukleinsavat, ezt pBRHtrp jellel jelöljük. Az adott fragmens jelenlétét restrikciós enzimmel végzett analízissel bizonyítjuk. A pBRHtrp plazmid p-laktamáz enzimet határoz meg, amelynek következménye az ampicillin rezisztencia, tartalmaz továbbá egy olyan dezoxi-ribonukleinsav- fragmenst, amely hordozza a trp promoter-operátor rendszert. A dezoxi-ribonukleinsavfragmens kódolja az LE’ proteint, ez áll a trp vezető szakasz első 6 aminosavából és a trp E polipeptid utolsó harmadából, továbbá egy második proteinből (ezt D’ jellel jelöljük), amely utóbbi megfelel a trp D polipeptid első felének. A fúziós protein áll továbbá egy harmadik protein szakaszból is, ezt a tetraciklin rezisztencia gén kódolja. C) A pSOM7A2 plazmid előállítása A pBRHtrp plazmidot EcoRI restrikciós enzimmel emésztjük, és a kapott fragmenst, amit poliakril-amid gél-elektroforézissel és elektro-elucióval izolálunk, ligáljuk a pSOMll plazmid [Itakura és munkatársai, SCI., 198, 1056 (1977); a 2 007 676A számú brit szabadalmi leírás] EcoRI enzimmel emésztett fragmenséhez. A ligálást T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal végezzük, és a kapott dezoxi-ribonukleinsavval az előzőek szerint eljárva E. coli K12 294 törzset transzformálunk. A transzformáns baktériumokat ampicillint tartalmazó táptalajon szelektáljuk, és az így izolált ampicillinre rezisztens telepeket telep-hibridizációval [Gruenstein és munkatársai, PNAS., USA, 72, 3951-3965 (1975)]vizsgáljuk. A trp promoter/operátor rendszert tartalmazó fragmenst a pBRHtrp plazmidból izoláljuk, és P32 izotóppal radioaktívan jelezzük. Ezt használjuk a telep-hibridizációkor próbaként. Több telep pozitív eredményt adott a telephibridizáció során, és ezeket kiválasztjuk. Izoláljuk belőlük a plazmid dezoxi-ribonukleinsavat, és a beépült fragmensek orientációját Bgin és BamHI restrikciós enzimekkel kivitelezett analízissel határozzuk meg. A kettős emésztés szerint a megfelelő plazmidot trp promoter/operátor-fragmenssel tartalmazó telepeket LB táptalajon növesztjük, ami 10 pg/ml ampicíllint tartalmaz. A plazmidot pSOM7A2 jellel jelöljük, és felhasználjuk a továbbiakban. D) A pTrp24 plazmid előállítása 1) Az LE' polipeptid távolabbi régióit meghatározó kodonokat és az 5’- illetve a 3'-kódoló szálvégeken Bglíl és EcoRI restrikciós helyeket tartalmazó génfragmens előállítása A pSOM7A2 plazmidot Hindin enzimmel emésztjük, majd az emésztést lambda exonukleázzal megismételjük (ez 5’-3’-exonukleáz). Az emésztést olyan körülmények között végezzük, hogy az LE’ proteint meghatározó szakaszon belül a Bglíl restrikciós hely mellett történjen a hasítás. 20 pg Hindin enzimmel emésztett pSOM7A2 dezoxi-ribonukleinsavat az alábbi összetételű pufferban oldunk: 20 mmól glicin-puffer, pH = 9,6, 1 mmól magnézium-klorid és 1 mmól ß-meikapto-etanol. Az elegyhez 5 egység lambdaexonukleázt adunk, és 60 percen át szobahőmérsékleten inkubálunk. A reakcióelegyet ezután fenollal, majd ezután kloroformmal extraháljuk, és etanollal kicsapjuk. Az LE’ génfragmens távolabbi végére EcoRI'helyet építünk be. Crea és munkatársai módszerével [lásd Crea és munkatársai, 1978 (lásd előbb)] a továbbfejlesztett foszfotriészter-módszerrel pCCTGTGCATGAT32 prímért szintetizálunk, és hibridizáljuk a lambda-exonukleázos kezelést követően kapott LE’ génfragmens egyszálú szakaszához. A hibridizációt úgy végezzük, hogy 20 pg lambda-exonukleázzal kezelt pSOM7A2 Hindin emésztett plazmidot oldunk 20 pl vízben, és az oldathoz 6 pl, 80 pikomól fentiekben megadott 5’- foszforilezett oligonukleotidot adunk. A szintetikus fragmenst az LE’ proteint kódoló szekvencia 3’-végéhez hibridizáljuk, és a visszamaradó egyszálú szakaszt a LE’fragmensen Klenow polimeráz I enzimmel töltjük fel dATP, TTP, dGTP és dCTP jelenlétében. A Klenow polimeráz I a dezoxi-ribonukleinsav polimeráz I proteolitikus hasítása után kapott fragmens. Ez 5’-3’polimerizáló aktivitással rendelkezik, továbbá bír 3’- 5’- exonukleotikus aktivitással, de nem rendelkezik a szülőenzim 5’-3’-exonukleotikus aktivitásával [Komberg, W. H. Freeman és Co., San Francisco, California, USA (1974)]. A reakcióelegyet 50 °C hőmérsékletre melegítjük fel, és ezután lassan 10 “C hőmérsékletre hűtjük, amiután 4 pl Klenow enzimet adagolunk. 15 percen át szobahőmérsékleten inkubáljuk a reakcióelegyet, az inkubálást 30 percen át 37 °C hőmérsékleten folytatjuk, ezután a reakciót 5 pl 0,25 mólos etiléndiamin- tetraecetsav-oldat adagolásával leállítjuk. Fenollal, majd ezután kloroformmal extraháljuk a reakcióelegyet, a dezoxi- ribonukleinsavat pedig etanollal kicsapjuk. A kivált dezoxi- ribonukleinsavat Bglíl restrikciós endonukleázzal hasítjuk, és a fragmenseket poliakril-amid gél-elektroforézissel különítjük el. A gélről felvett autoradiogram szerint jelen van egy P32- jelzett fragmens, ezt elektroelucióval kinyeijük. A termék 470 bázispár hosszúságú. Ahogy 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 15
