200366. lajstromszámú szabadalom • Eljárás módosított higromicin rezisztencia gén előállítására
1 HU 200366 B 2 azt már közöltük, ez a LE’ (d) fragmens BglII véggel rendelkezik, továbbá egy tompa véggel, ez a primer kezdetével lép kapcsolatba. 2) A pTHal plazmid előállítása A pTHal plazmid előállítására a timozin a 1 szintetizált gént beépítjük a pBR322 plazmidba. A timozin a 1 fehérjét meghatározó dezoxi-ribonukleinsav szintézisét követően az 5. ábrán nyilakkal jelzett 16 oligo-nukleotidot (Ti-Tiö) ligáljuk. Az N-végbe metionint meghatározó ATG kodont építünk be, és b az 5’- végeken egy szálú kohéziv szakaszokat alakítunk ki az EcoRI és BamHI-enzimekkel hasított plazmiddal való kapcsolhatóság érdekében. A génben levő BglII hely érthetően lehetőséget nyújt a rekombináns plaz- 5 midok analíziséhez. A T1-T16 oligo-dezoxi-ribonukleotidokat a módosított foszfotriészter-módszerrel állítjuk elő, teljesen védett tridezoxi-ribonukleotid építőköveket használva [Itakura és munkatársai (1977) és Crea és munkatársai 10 (1978), lásd előbb]. A különböző olígo-dezoxi-ribonukleotidokat az I. táblázatban mutatjuk be. I. Táblázat A timozinal gén előállításához használt szintetikus oligonukleotidok Vegyület Szekvencia Hoszszúság Retenciós idő HPLC-analíziskor (perc)x Ti A-A-T-T-C-A-T-G-T-C 10 17,4 T2 T-G-A-T-G-C-T-G-C-T-G-T-T-G-A 15 24,3 t3 T-A-C-T-T-C-T-TOC-T-G-A 12 20,3 t4 G-A-T-T-A-C-T-A-C-T-A-A-A 13 22,0 t5 G-C-A-G-C-A-T-C-A-G-A-C-A-T-G 15 24,8 t6 G-A-A-G-T-A-T-C-A-A-C-A 12 20,1 t7 A-G-T-A-A-T-C-T-C-A-G-A-A 13 22,6 Tg A-A-G-A-T-C-T-T-T-A-G-T 12 20,2 t9 G-A-T-C-T-T-A-A-G-G-A-G 12 20,4 Tio A-A-G-A-A-G-G-A-A-G-T-T 12 2U Tu G-T-C-G-A-A-G-A-G-G-C-T 12 20,5 Ti2 G-A-G-A-A-C-T-A-A-T-A-G 12 20,4 T13 C-T-T-C-T-T-C-T-C-C-T-T 12 19,9 Tl4 T-T-C-G-A-C-A-A-C-T-T-C 12 20,5 Tl5 G-T-T-C-T-C-A-G-C-C-T-C 12 20,2 Tlö G-A-T-C-C-T-A-T-T-A 10 17,2 x = Szobahőmérsékleten. A mellékelt 6. ábrán összefoglaljuk a szintetikus oligo- nukleotidok előállításának módját a Ti5-fragmens előállítása kapcsán. A Ti5-fragmens szintézisére használt különböző nukleotid-fragmenseket az ábrán számokkal adjuk meg. A rövidítések az alábbi jelentésiek: TPSTe = 2.4,6-triizopropil-benzol-szulfonil-tetrazol; BSA = benzol-szulfonsav; DMT = 4,4'-dimetoxi-tritil-csoport; CE = 2-ciano-etil-csoport; R = p-klór-fenil-csoport; Bz = benzoilcsoport; An = anizoilcsoport; iBu = izobutirilcsoport; Py = piridin; AcOH = ecetsav, és Et3N = trietil-amin. 85 mg (0,05 mmól) teljesen védett 4 tridezoxi-ribonukleotidot és 180 mg (0,1 mmól) 2 szintén teljesen védett tridezoxi- ribonukleotidot az 5’-hidroxil-csoportokon hasítunk 2 %-os, kloroform és metanol 7 : 3 arányú elegyével készült benzol- szulfonsavval. A reakciót 0 ’C hőmérsékleten végezzük 10 percen át. A reakció leállítására 2 ml telített, vizes ammónium-bikarbonátot adagolunk, az elegyet 25 ml kloroformmal extraháljuk, és kétszer 10 ml vízzel mossuk. A szerves oldószeres fázist magnézium- szulfáttal vízmentesítjük, 5 ml térfogatúra töményítjük, és pet- 45 rol-éterrel (35 - 60 ”C-os frakció) kicsapjuk. Centrifugálással összegyűjtjük a színtelen csapadékot, és csökkentett nyomású térben szárítjuk, amiután megkapjuk a 6 és 8 jelű vegyületeket. Ezek Merck 60 F254 szilikagélen végzett vékonyréteg-kromatográfiás 50 vizsgálat (kloroform és metanol 9 : 1 arányú elegyével végezve a futtatást) szerint homogének. 270 mg (0,15 mmól) 1 és 145 mg (0,075 mmól) 3 trimert foszfodiészterré (5 illetve 7 vegyületek) alakítunk úgy, hogy szobahőmérsékleten, 25 percen 55 át trietil-amin, piridin és víz 1 : 3 : 1 arányú elegyével, összesen 10 ml-rel kezeljük. Rotavaporban eltávolítjuk a reagenseket, és a desztillációs maradékot háromszor 10 ml vízmentes piridinnel desztillálva szárítjuk. 0,05 mmól 8 trimert és 7 trimert 3 ml 60 vízmentes piridinben 50 mg (0,15 mmól) 2,4,6-triizopropil-benzol-szulfonil-tetrazollal elegyítünk, és a reakcióelegyet szobahőmérsékleten, csökkentett nyomású térben hagyjuk állni 2 órán át. A vékonyréteg-kromatográfiás analízis szerint a 8 trimer 95 %-a 65 hexamerré alakult (a vizsgálatot úgy végezzük, hogy 16
