200366. lajstromszámú szabadalom • Eljárás módosított higromicin rezisztencia gén előállítására
1 HU 200366 B 2 izolálására tenyésztjük. A pIT123 plazmid restrikciós térképét a mellékelt 1. ábrán adjuk meg. 3. példa A plT144 plazmid és az E. coli K12 RRlAM15/plT144 törzs előállítása A) A pfT123 plazmid ÍJ kb nagyságú BamHI-BgllI fragmensének előállítása és izolálása Az emésztést és izolálást a 2. példa A) pontjában megadottak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy BamHI és Bgin restrikciós enzimet és reakcióelegyet használunk a Hphl és PstI restrikciós enzimek, illetve az ezekhez tartozó reakcióelegyek helyett. B) A pUC7 plazmid emésztése BamHI enzimmel A 2. példa A) pontjában megadottak szerint járunk el, azzal a különbséggel, hogy 1 pg pUC7 plazmidot (beszerezhető az alábbi helyen: Bethesda Research Laboratories, 8717 Grovemont Circle, RO. Box 6009, Gaithersburg, MD 20877) használunk a BamHI linkért tartalmazó dezoxi-ribonukleinsav helyett. C) Ligálás és transzformálás A pIT123 plazmid 1,3 kb nagyságú BamHI-BgllI fragmensének 1 |0.g-ját 1 pg BamHI enzimmel emésztett pUC7 dezoxi-ribonukleinsavval ligáljuk, és a kapott eleggyel E. coli K12 RR1AM15 sejteket transzformálunk. (A törzset a National Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois állandó törzsgyűjteményében találjuk meg NRRL B-15440 sorszámon). Mindkét eljárást, mind a ligálást, mind pedig a transzformálást a 2. példa B) pontjában megadottak szerint végezzük el. A transzformált sejteket 50 pg/ml ampicillint, 100 mmól izopropil-tio-ß-D-galaktozidot (IPTG) és 0,02 % 5-bróm-4-klór-3-indolil-(i-D-galaktozidot (X-gal) tartalmazó TY agaron szélesztjük. A fehér színű, ampicillinre rezisztens telepeket 50 pg/ml ampicillint, 200 pg/ml higromicin B antibiotikumot és 100 mmól IPTG-t tartalmazó TY lemezekre replikáljuk. A higromicin B antibiotikumra rezisztens sejtek az E. coli K12 RRlAM15/pIT144 transzformánsok. Ezek azonosítását restrikciós enzimes kezeléssel és agaróz gél-elektroforetikus analízissel bizonyítjuk a plazmidok izolálása után. A kapott E. coli K12 RRlAM15/pIT144 transzformánsokat a pIT144 plazmid termelésére és izolálására tenyésztjük. A pIT144 plazmidot könnyen transzformálhatjuk E. coli sejtekbe, például E. coli K12, E. coli K12 RR1, E. coli K12 JA221 vagy E. coli K12 HB101 törzsekbe. A transzformációkat a 2. példa B) pontjában megadottak szerint végezzük. A pIT144 plazmid restrikciós térképét a mellékelt 2. ábrán adjuk meg. 4. példa A plT208 plazmid és az E. coli KI2 JA22I/plT208 előállítása A) A pIT207 plazmid előállítása 1) A plTH8 plazmid 750 bázispárból álló Bam- HI-Bglll fragmensének előállítása és izolálása a] A pIT 118 plazmid izolálása A plT 118 plazmidot az E. coli K12 JA221/pIT118 törzsből izoláljuk az 1. példa A) pontja szerint eljárva. A fenti törzset a Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois, állandó törzsgyűjteményében találjuk meg NRRL B-15441 sorszámon. b] Emésztés Az emésztést és az izolálást a 2. példa A) pontja szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy a Hphl és PstI restrikciós enzimek helyett a BamHI és a BglII restrikciós enzimeket használjuk. 2) A pMC1587 plazmid emésztése BamHI restrikciós enzimmel Az emésztést a 2. példa A) pontja szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy a BamHI linkért tartalmazó dezoxi- ribonukleinsav helyett 2 pg pMC1587 plazmidot használunk. A pMCl587 plazmidot könnyen izolálhatjuk az 1. példa A) pontja szerint eljárva E. coli K12 JA221/pMC1587 törzsből. A törzs a Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois, állandó törzsgyűjteményében található NRRL B-15442 sorszámon. Mivel a pMC1587 plazmidban egyetlen BamHI hely található, az emésztés agaróz-gél-elektroforézissel könnyen követhető. Ha egy körülbelül 16 kb nagyságú egyetlen csík jelenik meg, úgy az emésztés teljessé vált. 3) Ligálás és az E. coli K12 JA22I transzformálása A pITl 18 plazmid 750 bázispárból álló BamHIBgllI fragmensének 1 pg-ját ligáljuk 1 pg, előzőleg BamHI enzimmel emésztett pMC1587 plazmiddal és a kapott ligációs eleggyel E. coli K12 JA221 (NRRL B-15211) sejteket transzformálunk. Mindkét lépést a 2. példa B) pontjában megadott ligáláshoz és transzformációhoz hasonlóan végezzük. Az ampecillinre rezisztens transzformánsokat ismert módon vizsgáljuk a 750 bázispárból álló fragmens megfelelő orientációjának bizonyítására, a vizsgálatokat restrikciós enzimmel és agaróz gél-elektroforetikus analízissel végezzük. A BamHI/BglII kapcsolással rendelkező plazmidok (a 750 bázispárból álló fragmens ligálásakor alakul ki), a pIT207 plazmid leu 2 gén közelében helyezkedik el. Az E. coli K12 JA221/pIT207 transzformánsokat a pIT207 plazmid termelésére és izolálására tenyésztjük. B) A pIT208 plazmid előállítása 1) A pIT207 plazmid emésztése BamHI enzimmel Az emésztést a 2. példa A) pontjában megadottak szerint végezzük azzal a különbséggel, hogy a BamHI linkért tartalmazó dezoxi-ribonukleinsav helyett 1 pg pIT207 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat használunk. 2) Az E. coli K12 JA22IlpIT208 előállítása ligációt követően A 3. példa A) pontjában megadottak szerint előállított pIT123 plazmid 1,3 kb nagyságú BamHI-BgllI fragmensének 2 pg-ját ligáljuk 2 pg pIT207 plazmiddal BamHI emésztését követően. A ligációs eleggyel E. coli K12 JA221 (NRRL B-15211) sejteket transzformálunk. A ligálást és a transzformációt a 2. példa B) pontjában megadottak szerint végezzük. Az ampicillin rezisztens transzformánsokat vizsgáljuk az 1,3 kb nagyságú fragmens jelenlétére és megfelelő orientációjára. A vizsgálatot restrikciós enzim és agaróz gélen kivitelezett elektroforetikus analízissel végezzük. Az 1,3 kb nagyságú fragmensben egy belső EcoRI helyet tartalmazó plazmidot a leu 2 génhez 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 12
