200366. lajstromszámú szabadalom • Eljárás módosított higromicin rezisztencia gén előállítására
1 HU 200366 B 2 közel helyezkednek el a pIT208 plazmidokban. Az E. coli K12 JA221/pIT208 transzformánsokat a pIT208 plazmid termelésére és izolálására tenyésztjük. A pIT208 plazmid tartalmazza: 1) a rövidített YG101 gént transzlációs leolvasási fázisban kapcsolva, a találmány szerinti dezoxi-ribonukleinsavhoz; 2) az élesztő leu 2 génjét, amely lehetővé teszi a plazmid szelektálását a leu 2 auxotrófok komplementációja révén; 3) az élesztő 2 p-os szekvenciáját, ez lehetővé teszi az élesztőben való önálló replikádét; 4) a pBR322 plazmidból származó replikációs origót, ez lehetővé teszi az E. coli sejtekben való önálló replikádét; végül 5) a pBR322 plazmidból származó B-laktamáz gént, ez lehetővé teszi a plazmid szelektálását E. coli sejtekben. A pIT208 plazmid restrikciós térképét a mellékelt 3. ábrán adjuk meg. 5. példa A Saccharomyces cerevisiaelpIT208 előállítása A Saccharomyces cerevisiae sejteket transzformáljuk a pIT208 plazmiddal Hinnen és munkatársai szerint eljárva [Proc. Nat. Acad. Sei., USA, 75, 1929 (1978)]. Bár különböző élesztőket használhatunk, mi a Saccharomyces cerevisiae DBY746 törzset használjuk. A törzs az alábbi forrásból szerezhető be: Yeast Genetics Stock Center, Department of Biophysics and Medical Physics, University of California, Berkeley, California 94720. 100 ml tenyészetben növesztjük az élesztő sejteket 30 *C hőmérsékleten, az alábbi összetételű YPD jelű táptalajban: 1 % Bacto-élesztőkivonat, 2 % Bacto-pepton és 2 % D-glükóz. A növesztést addig végezzük, míg az Aeoo : 1. Steril körülmények között centrifugáljuk a sejteket, és kétszer 15 ml, 1,2 mólos szorbitoldattal mossuk, majd 15 ml szorbit-oldatban szuszpendáljuk. A szuszpenzióhoz 100 pl , 2,5 mg/ml töménységű zimoliáz-oldatot adunk (60 000 egység, 5 mmólos kálium-foszfát- oldatban, pH = 7,6, 1,2 mólos szorbittal kiegészítve). A zimoliázt az alábbi forrásból szereztük be: Miles Laboratory, P.O. Box 2000, Elkhart, IN 46515. A protoplaszt képződés mértékét 180 pl 10 %-os nátrium-dodecil-szulfát adagolásával ellenőrizzük úgy, hogy az előbbi mennyiségű oldatot 20 ml protoplaszt-oldathoz adjuk, és fáziskontraszt mikroszkóp alatt vizsgáljuk. Ha a sejtek 90 %-a feketévé válik, a sejteket enyhe centrifugálással összegyűjtjük, és kétszer 15 ml, 1,2 mólos szorbit-oldattal mossuk, 10 ml 1,2 mólos szorbit-5X YPD-oldat elegyében szuszpendáljuk, és 40 percen át szobahőmérsékleten inkubáljuk. Enyhe centrifugálással újra összegyűjtjük a sejteket, és 600 pl alábbi összetételű oldatban szuszpendáljuk: 0,5X YPD-oldat, 1,2 mólos szorbit-oldat, 10 mmól kalcium-klorid és 10 mmól trisz- hidrogénklorid, pH = 7,5.0,2 ml-es alikvotokat veszünk a szuszpenzióból, és 20 pl dezoxi-ribonukleinsavat tartalmazó, 1,2 mólos szorbit-oldathoz adjuk. A transzformációs elegyet 10 percen át szobahőmérsékleten inkubáljuk, majd 1 ml alábbi összetételű oldatot adunk hozzá: 20 % polietilénglikol 4 000, 10 mmól kalcium-klorid, 10 mmól trisz-hidrogén-klorid, pH = 7,5. Az elegyet 60 percen át szobahőmérsékleten inkubáljuk, és ezután négy részre osztjuk. A szétosztott adagokat az alábbi összetételű ferdeagarokra oltjuk: 3 % agar, 0,67 % Difco élesztő nitrogénbázis, aminosavakat nem tartalmaz, 1,2 mól szorbit, 2 % glükóz, 2 % YPD és más, ismert táptalaj -összetevők. Ezenkívül a leucin prototrófok szelektálására hisztidint, leucint és triptofánt is adagolunk. A sejteket enyhén összekeverjük, és azonnal egy üres steril petricsészébe öntjük, majd, amiután az agar megszilárdult, 30 ’C hőmérsékleten inkubáljuk, megfelelő páratartalom mellett. 3 nap múlva a leucin prototrófokat izoláljuk, és 500 pg/ml higromicin B antibiotikumot tartalmazó YPD szilárd halmazállapotú táptalajra szélesztjük. A kapott higromicin B antibiotikumra rezisztens élesztősejtek a Saccharomyces cerevisiae/pIT208 transzformánsok. A transzformánsok azonosítását restrikciós enzimes és agaróz gélen kivitelezett elektroforetikus analízissel tovább bizonyítjuk. (A transzformációhoz használt polietilénglikol 4 000-t az alábbi helyen szereztük be: Baker Biochemicals, 222 Red School Lane, Phillipsbuig, NJ 08865). 6. példa A pKC307 plazmid és az E. coli K12 RRl AM 15/pKC307 előállítása A) A pIT104 plazmid és az E. coli KI2 RRl/pIT104 előállítása Az alábbi összetételű elegyet inkubáljuk 37 °C hőmérsékleten, 15 percen át: 1,5 pl (1 pg) pKC222 SacI enzimmel hasított plazmid dezoxi-ribonukleinsav, 0,5 pl, 10X puffer (0,5 mól trisz, pH = 7,5, 0,1 mól manézium-klorid), 0,5 - 0,5 pl (200 - 200 mmól) dCTP, dATP, dl'lP és dGTP, továbbá 1 pl, 1 egység dezoxi- ribonukleinsav polimeráz I nagy (Klenow) fragmenst tartalmazó oldat. A polimerázt hővel inaktiváljuk, majd BamHI linkereket adagolunk Roberts és Lauer szerint eljárva [1979, lásd előbb]. A BamHI linkereket [d(CCGGATCCGG)] az alábbi forrásból szereztük be: Collaborative Research, 128 Spring Street, Lexington, Massachusetts 02173. A kapott, BamHI linkért tartalmazó dezoxi- ribonukleinsavat BamHI restrikciós enzimmel emésztjük, és ezután a 2. példa B) pontjában megadottak szerint eljárva ligáljuk. A kiindulási plazmidok számának csökkentésére SacI restrikciós enzimmel emésztünk, majd a kapott pIT104 dezoxi-ribonukleinsavval Wensink szerint eljárva transzformálunk [Wensink, 1974 (lásd előbb)]. A transzformált E. coli K12 RRl (NRRL B-15210) sejteket LB lemezekre szélesztjük [Rosenberg és Court, Ann. Rev. Genet., 13, 319 (1979)]. A táptalaj ml-enként 50 pg ampicillint is tartalmaz. A kapott, ampicillinre rezisztens E. coli K12 RRl/pIT104 sejteket ismert módon izoláljuk, és a pIT104 plazmid termelésére és izolálására tenyésztjük. A pIT104 plazmid szerkezetét transzformálással, szelekcióval, restrikciós enzimes kezelésével és szekvencia-analízissel igazoljuk. B) A plT104 plazmid emésztése Hphl enzimmel Az emésztést a 2. példa A) pontjában megadottak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy a pKC222 plazmid helyett pIT104 plazmidot használunk, és PstI emésztést nem végzünk. A kapott pIT104 plazmid Hphl hasított alakját további tisztítás nélkül használjuk fel. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 13
