200342. lajstromszámú szabadalom • Enzimatikus eljárás L-2-amino-4-(hidroxi-metil-foszfinil)-vajsav előállítására
HU 200342 B OMPB-t L-glutaminsav mint amino-donor jelenlétében L-AMPB-vé képes átalakítani, és amelyet az említett, GOT-aktivitással is rendelkező transzaminázokkal együtt alkalmazhatunk, lehet bármely olyan transzamináz, amely képes az OMPB-t L-glutaminsav jelenlétében L-AMPB-vé átalakítani A találmány szerinti eljárásban amino-donorként bármely ismert amíno-dooor alkalmazható, például azok, amelyeket a következő források ismertetnek: SEIKAGAKU JIKKEN KOZA, U, Metabolism of Amino-acids and Bio-amines, szerkesztő: Hie Japanese Biochemical Society, kiadó. Tokyo Kagaku Dozin Company Limited; Jorunal of Biological Chemistry, 247,2486 (1972). A találmány szerinti eljárásban előnyösen alkalmazható amino-donor vegyületek például az egyenes szénláncú alifás L-a-aminosavak, mint például L-glutaminsav, L-aszparaginsav, L-alanin, L-metionin, L-glutamin stb: elágazó szénláncú alifás L-aaminosavak, mint például L-leucin, L-izoleucin, L- valin stb; bázikus aminosavak, mint például L-lizin, L-ornitin, L-hisztidin stb; valamint aromás aminosavak mint például L-fenilalanin, L-tirozin, L-triptofán stb. alkalmazható továbbá ezeknek az aminosavaknak az alkálifémsója, például nátrium- vagy káliumsója. Emellett a találmány szerinti eljárásban amino-donorként alkalmazhatók az említett L-aminosavaknak megfelelő megfelelő D-aminosavak. Az amino-donorok alkalmazhatók önmagukban vagy kombinációban. Amino-donorként előnyösen glutaminsavat vagy sóját alkalmazunk aszparaginsawal vagy sójával kombinálva. Az aminodonor mólaránya a reakcióközegben jelenlevő OMPB mennyiségéhez viszonyítva általában 10:1 és 1:10 között van a reakció kezdetén. Ha a találmány szerinti eljárásban amino-donorként glutaminsavat és/vagy aszparaginsavat alkalmazunk, akkor általában a kereskedelemben kapható glutaminsavat vagy aszparaginsavat alkalmazzuk. Általában ezek az aminosavak a D-izomer és L-izomer elegyének formájában lehetnek. Előnyös azonban L-izomeijük. A glutaminsav és aszparaginsav sójaként alkálifém sójuk, különösen nátrium- vagy káliumsójuk alkalmazható. A találmány szerinti eljárás egyik előnyös kiviteli módja szerint glutaminsavat (vagy sóját) és aszparaginsavat (vagy sóját) alkalmazunk kombinációban. Az egyes amino-donor vegyületek koncentrációját és az amino-donor vegyületek OMPB-hez viszonyított arányát az alábbiakban leírt módon határozzuk meg. Ha az amino-donor vegyületek nagyobb mennyiségben vannak jelen a reakcióközegben, mint az OMPB, akkor a reakció sebessége és az OMPB L-AMPB-vé történő átalakulásának aránya növekedhet. Az amino-donor vegyület és az OMPB megfelelő aránya azonban gazdasági szempontból határozható meg. Általában a glutaminsav vagy sójának mólaránya (vagy adagolandó mennyisége) az OMPB koncentrációjához viszonyítva előnyösen 0,2:1 és 3,0:1 határok között van. Másrészt az aszparaginsav vagy sójának mólaránya (vagy adagolandó mennyisége) az OMPB koncentrációjához viszonyítva előnyösen 0,2:1 és 3,0:1 határok között van. Másrészt az aszparaginsav vagy sójának mólaránya (vagy adagolandó mennyisége) az 7 OMPB koncentrációjához (vagy adagolandó mennyiségeéhez) viszonyítva előnyösen 1,0:1 és 3,0:1 között van. Ha a találmány szerinti eljárásban egy transzamináz termelő mikroorganizmust kívánunk reagáltatni a (II) általános képlető OMPB-vel és az amino-donorral, az eljárást úgy hajtjuk végre, hogy a mikroorganizmust először olyan táptalajon tenyésztjük, amely a mikroorganizmus tenyésztéséhez szükséges tápanyagokat tartalmazza. Tápanyagforrásként bármely szokásos tápanyagforrást alkalmazhatunk, amely a mikroorganizmusok szokásos tenyészetében alkalmazható. Szénforrásként alkalmazhatunk például glükózt, keményítőt, glicerint, szacharózt, sűrű malátaszirupot, melaszt stb. Ezeket alkalmazhatjuk önmagukban vagy kombinációban. Nitrogénforrásként alkalmazhatunk például szójabablisztet, búzacsírát, húskivonatot, peptont, szárított élesztőt, kukorica áztatólét, ammóniumszulfátot stb., önmagukban vagy kombinációban. A tápközeghez adagolhatunk egy vagy több szervetlen sót is, például kálcium-karbonátot, nátrium-kloridot, kálium-kloridot, vagy foszfátot, ahogyan szükséges. A mikroorganizmusokat előnyösen folyékony tápközegben, különösen szubmerz tenyésztéssel tenyésztjük. A mikroorganizmusok tenyésztését aerob körülmények között végezhetjük. A tenyésztést előnyösen 25 és 40 #C közötti hőmérsékleten végezzük. A tenyésztést előnyösen 1-4 napig végezzük aktinomiceták esetén, baktériumok esetén 1-2 napig, élesztők esetén 1-2 napig és penészek esetén 1-4 napig. A transzamináz termelő mikroorganizmusok tenyésztésével így kapott tenyészközeget önmagában alkalmazhatjuk. Kívánt esetben a mikroorganizmus sejteket elválaszthatjuk a tenyészközegtől és moshatjuk vízzel, vagy fiziológiás sóoldattal. A kapott, mosott, ép sejteket ezután vízben, fiziológiás sóoldatban vagy alkalmas vizes pufferolt oldatban szuszpenzáljuk a kívánt sejtkoncentráció eléréséhez. A tenyészközeghez vagy a mikroorganizmus sejteket tartalmazó vizes szuszpenzióhoz adagoljuk azután az OMPB-t (első szubsztrát) és az aminodonor vegyületeket (második szubsztrát az enzim számára), párhuzamosan vagy egymás után. A kapott folyadékelegyet ezután olyan körülmények között tartjuk, hogy a mikroorganizmus reagáljon az OMPB-vel, és az aminó-donorral és így az OMPB- t L-AMPB-vé alakítsa át. A vizes reakciókőzegben a sejtkoncentrációt, az OMPB és az amino-donor koncentrációját, valamint a reakcióhőmérsékletet és a pH-t olyan értéken tartjuk, hogy a mikroorganizmus megfelelő sebességgel alakítsa át az OMPB-t L-AMPB-vé. A reakcióidőt úgy választjuk meg, hogy megfelelő mennyiségű L-AMPB szaporodjon fel a reakcióközegben. A találmány szerinti eljárás egy másik előnyös megvalósítási módja szerint az OMPB-t és aminodonort a transzamináz vizes vagy pufferes oldatához adagoljuk és oldjuk, majd lefolytatjuk az OMPB-enzimes reakcióját. A transzamináz OMPB és amino-donor megfelelő koncentrációját a reakciórendszerben, valamint a reakcióhőmérsékletet és pH-t olyan határok között választjuk meg, hogy az OMPB L-AMPB-vé történő átalaku8 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
