200313. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gyulladásellenes hatású 2,4,5-triszubsztituált-fenol-származékok és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
HU 200313 B 33 TV. táblázat folytatóra Vegyület ED50 (mg/k Példa száma 81 50 91 25 104 50 118 42 A találmány szerinti eljárással előállított vegyietek bármely betegség kezelésére alkalmasak kell legyenek, a klinikai helyzetet is beleértve, amelyet a túlzott leukotrién B4 felszabadulás jellemez. Ilyen betegségek az övsömör, az ízületi gyulladás, a krónikus tüdőbetegségek, a bélgyulladás és más gyulladásos betegségek, amelyeket a polimorf magvú leukociták aggregációja jellemez. A leukotrién B4 „túlzott felszabadulása kifejezés alatt a leukotrién olyan mennyiségét értjük, amely elegendő ahhoz, hogy olyan helyzetet hozzon létre, ami ehhez a mennyiséghez jellemzően tartozik. A LTB4 túlzottnak minősített mennyisége több tényező függvénye, mint például az adott tünetet okozó leukotrién szükséges mennyisége, és az adott emlős fajtája. Mint a szakember előtt ismert, egy emlős esetéből, amely olyan betegségben szenved, amely a túl- • zott leukotriői B4 kibocsátással jellemezhető, az, hogy ez az (I) általános képletú találmány szerinti vegyülettel hogyan kezelhető sikeresen a betegség szimptőmáinak visszaszorításában vagy megelőzésében kifejtett hatással határozandó meg. A leukotrién B4 antagonista hatást az alábbi tesztvizsgálattal mutattuk ki: Emberi perifériás neutrophilen való 3H-LTB4 mcgkötődés inhibiálása A találmány szerinti vegyületek hatásosságát mértük annak segítségével, hogy hogyan inhibiálják a leukotrién B4 megkötődését egy specifikus receptoron az emberi neutrophil membránján és erre egy radioaktív-ligandum megkötődési próbát alkalmaztunk, amelyet Goldman és Goetzl, J. Immunoi, 129.1600 /1982/, dolgozott Id. Más kutatók hasonló próbákat dolgoztak ki (lásd például Kreisle és munkatársai, J. Exp. Med., 157. 628 /1983/ és Lin és munkatársai, Prostaglandins, 28,837 /1984/ közleményeit). A kísérletben alkalmazott sejteket standard Ficoll- Hypaque dextrán 70 szedimentációs és kisnyomású sejtroncsoló centrifugálással nyerjük. Az alábbi eljárást alkalmaztuk. Frissen preparált álhártyás burok réteget nyertünk két egyéntől egy helyi véradóközpontban. A sejteket kevertük, majd 484 ml-re hígítottuk foszfáttal pufferolt fiziológiás sóoldattal, amely heparint (10 egység/ml), valamint hővel aktivált borjú szérumot tartalmazott Ezt 20 ml részletekre osztottuk és ezeket a részleteket Ficoll-Paque-ra (12 ml) lélegeztük. Ezután az anyagot 500 g erővel 40 percig szobahőmérsékleten centrifugáltuk. A vérlemezek és monomagvú sejtek felső rétegét eldobtuk. Az alsó réteget amely vörösvérsejteket és neutrophileket tartalmazott megőriztük. Ezután puffert (1 ml/4 ml-ként az alsó rétegre) adtunk hozzá és elkevertük. Ezen keverék minden ml-hez 0,33 ml 6% Macrodex-et adtunk. Elkcverés után a sejteket ülepedni hagytuk 1 óráig 37 *C-on. A kapott erythrocita labdacsoteldobtuk és a neutrophilben dúsult felúszót 10 pácig 4 *C- on 500 g erővel centrifugáltuk. Az ezen sejt maradék- 5 ban jelenlévő maradó erythrocitákat roncsoltuk a sejteket 5-8 ml jéggel hűtött desztillált vízben 30-45 másodpercig inkubálva. Ezután a térfogatot jéggel hűtött puffand 50 ml-re egészítettük ki és a sejteket újra szuszpendáltuk. A szuszpenziót ezután 300g erő- 10 vei 10 percig 4 *C-on centrifugáltuk. A sejteket végül újra szuszpendáltuk és 2xl0~ sejt/ml koncentrációt állítottunk be a kísérletben alkalmazott pufferben. Ez a puffer Hanks-féle kiegyenlített sóoldatból és 0,1% tojásfehéije-albuminból (pH 73) álL Az izolációs el- 15 járás a neutrophilek 90%-át megőrizte és ezek 90%ban rendelkezésre állnak (életképesek). A radioaktív ligandum megkötési kísérletet a neutrophilek (lxlO7 sejt) 0,1-03 nmól 3H-LTB4 (Apec. aktivitás 193-220 Curie/mól) & a tesztvizsgálatba vitt vegyület (lxlO5 20 mól és lxlO6 mól) inkubálásávalvégeztük 10 percig 4 *C hőmérsékleten. Ezután a 3H-LTB4 megkötött mennyiséget mértük és összehasonlítottuk a vizsgált vegyület jelenléte nélkül mát megkötött mennyiséggel. A kísérletet mikrocentrifuga csövekben végez- 25 tűk, amelyekben először 10 mikro 1 DMSO-ban oldott vizsgált vegyületet, majd 20 mikro 13H-LTB4-t adtunk, amely a kísérletben alkalmazott pufferrel hígított, és végül 500 mikro 1 sejtszuszpenziót adagoltunk. A10 perces inkubálás végén 300 mikro 1 dibu- 30 til- és dinonil-ftalát (7:2) elegyét adtunk a csövekbe és azokat 2 percig mikrocentrifugában centrifugáltuk. A sejt tömegéhez kötött radioaktivitást szcintillációval mértük. A nem specifikus 3H-LTB4 kötés megfelelő korrekcióját elvégeztük. Az eredményeket az V. 35 táblázatban közöljük. V. táblázat LTB4 megkötődés inhibiálása 34 40 Példa száma 10'5mól Hatóanyagkoncentráció 10"6 mól 10‘7mól 15 33 13 16 8-7 18 5 3 45 19 90 61 20 102 72 21 81 32 33 85 50 24 94 59 50 25 19 2 26 46 5 28 77 32 29 „ 52 12 30 37 7 55 31 30 14 36 40 7 37 31 8 38 16 8 39 50 9 60 40 31 8 41 59 22 42 6 12 44 47 9 45 51 15 65 46 72 26 18
