200278. lajstromszámú szabadalom • Eljárás stabil gamma-interferon készítmények előállítására
1 HU 200278 B 2 A találmány stabil, liofilizált gamma-interferon készítmények előállítására vonatkozik, amelyek vízben feloldva szobahőmérsékleten legalább 24 órán át viztiszták és biológiailag aktívak maradnak. A .gamma-interferon’ (GIF) kifejezés vonatkozik a természetes interferonra vagy a humán immun-interferonhoz hasonló biológiai tulajdonságokkal rendelkező rekombináns interferonra. A leírásban és az igénypontokban a gamma-interfei'on-A vagy GIF-A kifejezés olyan gamma-interferont jelent, amely 146 aminosavat tartalmaz, cisztein-tirozin-ciszterin aminosavakkal kezdődve és glutaminnal végződve. Ismeretes továbbá számos megrövidített, illetve hiányos gamma-interferon termék, a következőkben az egyes hiányos termékeket a leírásban egy nagy betűvel jelöljük a gamma-interferon megnevezés után. Például a GIF-D, amelyből hiányzik a cisztein-tirozin-cisztein fragmentum és Így csak 143 aminosavból áll, és a GIF-B, a GIF-A karboxil-végén hiányos, 131 aminosavat tartalmazó fragmentum. Valamennyi fragmentum alkalmazása a találmány tárgyához tartozik, bár a GIF legelőnyösebb formája a találmány szerinti alkalmazásban a GIF-A. Ismertették, hogy a gamma-interferon sejtburjánzás elleni szer, és erősiti az alfa- és béta-interferonok (vagyis a leukocita- és fibroblaszt-interferonok) vírusok és sejtburjánzás elleni hatását. Felmerült az az elgondolás, hogy a gamma-interferon szintén immunregulátor lehet. Az interferon-dózisformák előállításának egy ismert módszere szerinti az interferont más komponensekkel kombinálva liofilizálják, és ezt a liofilizátumot a felhasználás időpontjában vízzel feloldják (Sedmak és mtsai: Methods of Enzymology, 78. kötet, Interferons, A. rész, 1981, 591-595. oldal). Mivel a gamma-interferonról az irodalomból ismert, hogy savra érzékeny (nem úgy az alfa- és béta-interferonok, amelyek savas pH-nál stabilak), hagyományosan semleges vagy kissé lúgos pH-nál kezelték. igy például a 2 119 313 A számú brit szabadalmi leírás liofilizált készitményeket ismertet, amelyek 7-23 mikrogram/ml gamma-interferont tartalmaznak, 7,5 pH-értékü kész oldatban. Az ilyen semleges vagy kissé lúgos oldatok nagyobb gamma-interferon-koncentrációkkal (például: 0,2 mg/ml) injektálható készítményekként nem használhatók az azonnal képződő, látható csapadék miatt. Az ilyen kiválások nem kívánatosak több okból, például azért, mert a betegnél trombózist okozhat, valószínű a GIF hatóerő vesztesége és az összecsomósodás miatt az injekciós tűben. A 133 767 számú európai szabadalmi leírás olyan stabil, liofilizált gamma-interferon készitményeket ismertet, amelyek a gamma-interferon mellett cukrot vagy albumint, előnyösen humán albumint, továbbá jelentős mennyiségű sót, igy nátrium-kloridot tartalmaznak. A találmány tárgyát biológiailag stabil, liofilizált gamma-interferon készitmény előállítása képezi, amely gamma-interferont és egy kompatibilis puffert tartalmaz, emellett a puffer a vízzel 0,001-10, előnyösen 0,05- -10 mg gamma-interferon/ml koncentrációra elkészített adatot 4,0-6,0, előnyösen 4,5- -5,0 pH-értéken tartja. Meglepő módon a készítmények biológiailag és kémiailag stabil liofilizált porokat képeznek, amelyek vízben feloldva víztiszta oldatokat adnak. Mivel a gamma-interferont előnyösen parenterálisan adják be, a találmány szerint előállított készítmények elsősorban injekciós felhasználásokra, vagyis intramuszkuláris, intravénás és szubkután injekciókhoz alkalmazandók. Az ilyen készítmények azonban megfelelnek a gamma-interferon más beadási módjaihoz is, amelyekhez a GIF-oldat erre alkalmas más dózisformái szükségesek (például orrpermetek és helyi dózisformák, így szemészeti oldatok). A gamma-interferon savérzékenysége jól ismert, igy például J. Vilcek és munkatársai [Journal of Immunological Methods, 69, 61-70 (1984)] ismertetik, hogy a gamma-interferon alacsony pH-értéken instabil; kitermelték ugyan a gamma-interferon nagy részét egy 3.5 pH-értéken eluált kromatográfiás oszlopról, de csak abban az esetben, ha a frakciókat közvetlenül semlegesre pufferolt közegbe vezették. Alacsony pH-értéken a gamma-interferon oldatai savas protein-szolubilizáló szerekkel vagy ezek nélkül, mint például a humán szérumalbumin, kezdetben tiszták, ellentétben a semleges vagy kissé lúgos oldatokkal, amelyek zavarosak. Savas pH-értéken végül is képződik csapadék, de a szolubilizáló szer jelenléte lényegesen visszatartja a csapadékképződést. A találmány szerinti liofilizált porok 4.5 pH-értéken hosszabb tárolás (például 1 év) sorén stabilak maradnak hűtőben. Az elkészített oldatok tiszták maradnak, azaz csapadéktól és/vagy opálosságtól mentesek és szobahőmérsékleten vagy hűtőben legalább 24 órán át biológiailag stabilak maradnak. Mivel a port csak közvetlenül a felhasználós előtt kell feloldani, 24 óra több mint elég idő ahhoz, hogy az oldat az injekcióhoz viztiszta maradjon. Az elkészitett oldatok viztiszták és biológiailag stabilak maradnak hűtőben tárolva legalább két hétig. A leírásban a .biológiailag stabil" kifejezés azt jelenti, hogy az interferon készitmény biológiai aktivitása - egy vírus citopátiás hatásának (CPE) gátlását standard eljárással mérve - a fenti tárolási körülmények között lényegileg megmarad. Más, kevésbé kvantitatív biológiai funkciók, így a sejtbur-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
