200203. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 1,2-dehidro-szteroidok előállítására mikrobiológiai úton

HU 200203 B

7

8

Op.: 164-167 *C.

[oi]d= -i- 102* (c= 1, kloroform).

Ultraibolya színkép (etanol): Am« 238 nm (e=

15900).

Infravörös színkép (KBr): v C=01730,1655 (17- 5

es és 3-as ketonok), vC=01620,1602 cm'1

*H-NMR spektrum: (CDCfc 5): 73 (H-l), 6,2 (H- 2), 6,0 (H-4), AMXm (J^= 10Hz, J2>4= 2Hz, J2i4- O Hz), 5,6 m (H-ll), 1,4 s (2H-19), 0,95 s (3H-18) ppm. 10

Tömegspektrum: Molekula-ion: 282.

Jellemző ionok (m/z): 282, 267, 249, 239, 225,

224.209.91.

Az átkistályosítási anyalúgot vákuumban bepároljuk, a bepáriási maradékot preparatív vékonyrétegk- 15

romatográfiás módszerrel—kifejlesztő oldószerként etil-acetáL*n-hexán (1:1) elegyet használva—tisztítjuk. így további 1,18 g kromatográfiásan tiszta 1,4,9(1 l)-androsztatrién-3,17-dionhoz jutunk.

20

2. példa

Az 1. példában leírt módon eljárva 4-androsztén-3,17-dionnal indukált arthrobacter simplex [NCAIM B(P) 000066] tenyészetet készítünk. E tenyészet 10- 10 ml-ét sterilen 10 db 500 ml-es Erlenmeyer lombik- 25

ba mérjük, és 90-90 ml 1,8-1,8 g AmberUte XAD-2 adszorpciós gyantát tartalmazó steril vízzel hígítjuk.

A kapott tenyészetekhez 2 ml etanolban oldott 100 mg 3-0x0-23,24-dinor-4,9(1 l)-koladién-22-savat adagolunk lombikonként. A tenyészeteket 37 *C-on, 30 síkrázógépen, két napig rázatjuk. Ezután a tenyészeteket egyesítjük és a fermentlé pH-ját 2n kénsavval

2- es értácre állítjuk, majd háromszor 200 ml etil-acetáttal extraháljuk a fermentlét. Az etil-acetátos extraktumokat egyesítjük, és vákuumban bepároljuk. A 35 kapott 1,05 g nyersterméket preparatív vékonyrétegkromatográfiás módszerrel tisztítjuk [kifejlesztőszer benzol:aceton (8:2) elegy]. Akapott720mg kromatográfiásan egységes terméket 20 ml metanolban oldjuk, majd az oldathoz 1 ml 10%-os metanolos só- 40 savat adun 0 ‘C-on. Ezután a megsavanyított oldatot 100 ml etil-acetáttal hígítjuk, kétszer 25 ml vízzel mossuk, májúd vákuumban bepároljuk. Az így kapott

3- 0X0-23,24-dinor-l,4,9(ll)-kolatrién-22-savat acetonból kristályosítjuk át. 45

Op.: 220-225 *C.

Ultraibolya színkép (etanol): Am« 238 nm.

Infravörös színkép (KBr): v OH 3500-2500, vC=01705 (COOH), 1660 (3-as keton), vC=C 1620,

1600 cm'1. 50

^-NMR spektrum: (CDCI3 5:7,4 (H-l), 6,2 (H- 2), 6,0 (H-4), AMXm (Ji^lOHz, J2,4= 2Hz, J2l4- OHz), 5,5 m (H-ll), 1,4 s (3H-19), 1,15 d (3H-21),

0,7 s (3H-18) ppm.

Tömegspektrum: Molekula-ion: 340. 55

Jellemző ionok (m/z): 340, 325, 323, 312, 174,

105.93.91.

A fermentáció kiindulási anyagául használt 3-oxo-23,24-dinor-4,9(l l)-koladién-22-savat 9a-hidroxi- 3-0X0-23,24-dinor-4-kolén-22-savból például az 60

alábbi módon állíthatjuk elő:

2 g 9a-hidroxi-3-oxo-2334-dinor-4-kolén-22-savat feloldunk 20 ml diklór-metánban, az oldathoz -5 ‘C-on, keverés közben 1,2 ml klór-szulfonsavat csepegtetünk, majd az oldatot 30 percig ezen a hőmér- 65

sékleten kevertetjük. Ezután 25 ml vizet adagolunk a reakcióelegyhez keverés közben, majd a fázisokat szétválasztjuk. A vizes fázist kétszer 10 ml diklór-metánnal extraháljuk. Ezután a diklór-metános kivonatokat egyesítjük és vákuumban bepároljuk. A 2,05 g bepáriási maradékot preparatív vékonyrétegkromatográfiás módszerrel [kifejlesztő elegy: benzokaceton (8:2)] tisztítjuk. A kapott kromatográfiásan egységes tennéket 30 ml metanolban oldjuk és 2 ml 10%os metanolos sósavat adunk hozzá. Ezután a megsavanyított metanolos oldatot 120 ml etil-acetáttal hígítjuk, a nyert elegyet kétszer 25 ml vízzel mossuk, majd vákuumban bepároljuk. Az így kapott 1,5 g 3- oxo-23,24-dinor-4,9(ll)-koladién-22-savat metanolból kristályosítjuk át

Op.: 225-230 *C.

Ultraibolya színkép (etanol): A«« 238 nm.

Infravörös színkép (KBr): vOH 3500-2400, vC=01720 (COOH), 1650 (3-as keton), vC=C 1610 cm'1.

^-NMR spektrum: (CDCI3 8): 5,7 s (H-4), 5,5 m (H-ll), 1,2 d (3H-21), 135 s (3H-19), 0,7 s (3H-18) ppm.

Tömegspektrum: Molekula-ion: 342.

Jellemző ionok (m/z): 342, 327, 300, 269, 176,

105,93,91.

3. Példa

Az 1. példában leírt módon eljárva 4-androsztén- 3,17-dionnal indukált Arthrobacter simplex [NCAIM B(P) 000066] tenyészetet készítünk. E tenyészet 10- 10 ml-ét sterilen 10 db 500ml-es Erlenmeyer lombikba mérjük, és 90-90 ml 13-13 g Amberüte XAD-2 gyantát tartalmazó steril vízzel hígítjuk. A kapott tenyészetekhez 2 ml etanolban oldott 100 mg 3-oxo- 2334-dinor-43(ll),17(20)-kolatrién-22-savat adagolunk lombikonként. A tenyészeteket síkrázógépen, 37 *C-on, két napig rázatjuk. Ezután a tenyészeteket egyesítjük és a fermentlé pH-ját 2 n kénsavval 2-es értékre állítjuk, majd háromszor 200 ml etil-acetáttal

extraháljuk a fermentlét. Az etil-acetátos extraktumokat egyesítjük és vákuumban bepároljuk. A kapott 960mg nyersterméket preparatív vékonyrétegkromatográfiás módszerrel tisztítjuk [kifejlesztőszer: benzokaceton (8:2) elegyben]. A 710 mg kromatográfiásan egységes tennéket 20 ml metanolban oldjuk, majd az oldathoz 1 ml 10%-os metanolos sósavat adunk 0 ‘C-on. Ezután a megsavanyított oldatot 100 ml etil-acetáttal hígítjuk, kétszer 25 ml vízzel mossuk, majd vákuumban bepároljuk. Az így lopott 3- oxo-2334-dinor-l,4,9(11),17(20)-kolatetraén-22-savat metanolból kristályosítjuk át

Op.: 240-244 *C.

Ultraibolya színkép (etanol): Am« 235 nm.

Infravörös színkép (KBr): vOH 3600-2500, vC=01690(COOH), 1665 (3-as keton), vC=C 1630, 1610 cm'1.

‘H-NMR spektrum: (CDCb 5): 73 (H-l), 6,3 (H- 2), 6,1 (H-4), AMXm (Ji^= 10Hz, J2,4=2Hz, Ji,4~ 0Hz), 5,5 m (H-ll), 135 s (3H-21), 1,4 s (3H-19), 035 s (3H-18) ppm.

Tömegspektrum: Molekula-ion: 338.

Jellemző ionok (m/z): 338, 323, 310, 211, 165,

145,121,91.

A fermentáció kiindulási anyagául használt 3-oxo-5