200203. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 1,2-dehidro-szteroidok előállítására mikrobiológiai úton
HU 200203 B őnyösen alkalmazható nitrogén-forrásul a kukoricalekvár, az élesztókivonat és az aszparagin; szén-forrásként pedig a glicerin és a glükóz. A táptalajok jellegzetes alkotórészei és alkálifém és az alkáliföldfém-foszfát, -nitrát és -szulfátsók, nyomelemként hasznosak a kobalt-, zink-, réz-, nikkel- és mangánsók. Az 1 ^-helyzetű dehidrogénezést végző baktérium törzseket célszerűen 37-37 *C-on, a gombákat 25-30 ’C-on tenyésztjük. Egyes 1,2-helyzetben dehidrogénezó mikroorganizmusok esetében, például az Arthrobacter simplexnél, a 3-oxo-szteroid-Al-dehidrogenáz enzim mennyisége indukcióval jelentősen fokozható. A 3- oxo-szteroid-Al-dehidrogenáz enzim képződését célszerűen 4-androsztén-3,17-dion jelenlétében végzett inkubálással váltjuk ki, de alkalmazhatunk induktorként bármely 3-oxo-4-én vagy 3-oxo-l ,4-diénszerkezetű szteroidot is. A dehidrogénezést végeztethetjük az indukált törzsek tömény tenyészetével is, de előnyösebb a törzsek vízzel 10-20-szorosára hígított tenyészetét használni az átalakításhoz. A találmány szerinti eljárás egy előnyös kiviteli módja szerint úgy járunk el, hogy makropórusos polisztirol típusú lipofil adszorpciós gyantákat (Amberliter polimer adszorbensek, Rohm and Haas, GmbH, Frankfurt; Duolite adszorbens gyanták, Doulite International S-A., Vitry-sur-Seine; Diaion adszorbens gyanták, Mitsubishi Co., Tokió) használunk az 1,2- helyzetű dehidrogénezés folyamatának elősegítésére. Az adszorpciós gyantákat 1-31% mennyiségben célszerű adagolni a fermentléhez a szteroid átalakítás megkezdése előtt. Az 1 ^-helyzetben dehidrogénezett szteroid termékeket a fermentléből előnyösen klórozott szénhidrogénekkel, szerves észterekkel, vízzel nem elegyedő szerves ketonokkal és szerves alkoholokkal végzett extrakcióval különítjük el. A 23,24-dinor-kolánsav-származékok extrakciója előtt a fermentlét célszerű megsavanyítani a kivonás hatásfokának növelésére. Az extraktumok bepárlásával kapott nyerstermékeket átkristályosítással, szükség esetén kromatográfiás módszerekkel tisztíthatjuk. A találmány szerinti eljárással előállított vegyületek szerkezetét infravörös, 'H-NMR és tömegspektroszkópiai módszerekkel igazoltuk. A vékonyrétegkromatográfiás elválasztásoknak szilikagél adszorbenst [Kieselgel G (Reanal, Budapest) és Kieselgel 60 HF254+366 (Reanal, Budapest) 2:1 arányú keveréke] használunk. A találmány szerinti eljárás kiindulási anyagául szolgáló 4,9(1 l>dién-3-on szerkezetű szteroidok közül csupán a4,9(ll)-androsztadién-3,17-dion, továbbá a 27-nor-4,9(ll)kolesztadién-3,24-dion és a 26,27-dinor-4,9(ll)-kolesztadién-3,24-dion ismeretes az irodalomból. Az első vegyületet célszerűen a 189.351 sz. magyar szabadalmi leírás szerint, az utóbbiakat pedig J. C. Knight és M. G. Wovcha szerint [Steroids, 26.723 (1980)] állíthatjuk elő. Az új kiindulási vegyületek előállítását az egyes kiviteli példák kapcsán ismertetjük. A találmány kivitelezését az alábbi példákkal szemléltetjük: 5 1. példa Arthrobacter simplex [NCAIM B(000066] burgonyás-dextrózos ferdeagaron növesztett 1-2 hetes tenyészetéről 10 ml steril vízzel készített szuszpenzió 1 ml-ével 500 ml-es Erlenmeyer lombikban sterilezett 100 ml CS jelű táptalajt oltunk, melynek összetétele a következő: kálium-dihidrogén-foszfát 4,4 g dinátrium-hidrogén-foszfát 8,8 g élesztőkivonat (szárazanyag) 10,0 g 1000 ml csapvízben. A táptalaj pH-ját sterilezés előtt 7,0 értékre állítjuk. A táptalaj sterilezését 121 'C-on 25 percig végezzük. A tenyészetet 2 napig növesztjük síkrázógépen, 37 *C-on, majd 5-5 ml tenyészettel 5 db 500 ml-es Erlenmeyer lombikot oltunk, melyek 100-100 ml KA12 jelű steril táptalajt tartalmaznak. A KAS 12 jelű táptalaj összetétele a kövtkező: 6 kukoricalekvár (szárazanyag) 2,0 g aszparagin 1,0 g élesztőkivonat (szárazanyag) 0,2 g glükóz 5,0 g kálium-dihidrogén-foszfát 1,0 g nyomelem oldat* 10,0 ml 100 ml csapvízben. A táptalaj pH-ját sterilezés előtt 6,5-7,0 értékre állítjuk. A táptalaj sterilezését 121 'C-on 25 percig végezzük. * A nyomelem oldat összetétele: kalcium-klorid-víz (1:6) 1,0 g kobalt(II)-nitrát-víz(l:6) 10,0 mg cink-szulfát-víz (1:7) 88,0 mg réz(II)-szulfát-víz (1:5) 3,9 mg nikkel-szulfát-víz (1:7) 1,0 mg nátrium-tetraborát-víz (1:10) 0,8 mg mangán(II)-klorid-víz (1:4) 0,72 mg ammónium-foszfor-molibdenát-víz(l:6) 0,37 mg vas(II)-szulfát-víz(l:7) 1,0 mg 1000 ml desztillált vízben. A kapott tenyészeteket 37 'C-on síkrázógépen egy napig rázatjuk, majd 1 ml acetonban oldott 10 mg 4- androsztén-3,17-diont adunk mindegyik lombikba, és a rázatást 6 órán át folytatjuk. Ezután az inokulum tenyészeteket egyesítjük, és sterilen beadagoljuk 4,5 1 steril vízben 90 g Amberiite XAD-2 adszorpciós gyantát tartalmazó 10 literes laboratóriumi fermentorba. Ezután 75 ml tetrahidrofuránban oldott 6 g 4,9(ll)-androsztadién-3,17-diont adunk a tenyészethez. Ezt követően 24 ólán át végezzük a szteroidátalakítást 37 'C-on, 500/perc fordulatszámú kevertetés közben, 180 liter/óra steril levegő átáramoltatása mellett Ezalatt a vékonyrétegkromatográfiás analízis szerint a 4,9(1 l)-androsztadién-3,17-dion teljesen átalakul l,4,9(ll)-androsztadién-3,17-dionná. A kiindulási anyag és a törnék vékonyrétegkromatográfiás elválasztásánál n-hexán:etil-acetát (6:4) elegyet használunk kifejlesztőszerként A fermentáció befejezése után a fermentlevet először 1,5 1, majd 0,5 1 diklór-metánnal extraháljuk. Az egyesített diklór-metános extraktumot vízmentes nátrium-szulfáton szárítjuk, majd vákuumban bepároljuk. A kapott 5,75 g nyersterméket acetonból átkristályosítva 3,65 g tiszta 1,4,9(1 l)-androsztatrién-3,17-diont kapunk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
