200194. lajstromszámú szabadalom • Eljárás pertussis endotoxin eltávolítására
dőfrakcióban (HA-titer és PT-tartalom) a veszteség növekedne. I. táblázat 5 Adagolt endotoxin-endotoxin HA- PT- kalcium- tartalom eltávolítás titer tartalom-acélát (%) (töm/térf. %) (ng/ml) (%) (Hau^nl) (Eu/ml) 0 87800 — 1200 1220 oa 1043 98,2 1100 1140 0,4 960 98,9 1400 1400 0,6 720 99,2 1200 1080 0,8 78 99,9 400 1210 1,0 <20 >99,9 <200 1031 HA-titer főleg a FHA-tartalomra utal 2. referencia példa Az 1. referencia példa szerinti módon járunk el, azzal az eltéréssel, hogy a pH-t 5,0 és 10,0 érték között változtatjuk nátrium-hidroxid, ill. sósav segítségével, és az adagolt kalcium-acetát mennyisége 04 tömeg/térfogat%. Az eredményeket a II. táblázat mutatja. 6,0 pH értéktől gélesedés kezdődik és az endotoxin eltávolítása a pH emelkedésével fokozódik. AH. táblázatból látható, hogy az optimális pH érték 7-9. n. táblázat pH endotoxin-endotoxin tartalom eltávolítás (%) mértéke (ng/ml) (%) Ha-titer (HAu/ml) kezelés előtt 334000 __ 3000 5,0 195000 41,6 2700 6,0 108000 67,7 3000 64 53000 84,1 3000 7,0 24000 92,8 3000 8,0 22000 93,4 3200 9,0 18000 94,6 3000 10,0 268000 19,8 3000 3. referencia példa A 2. referencia példa szerinti módon járunk el, azzal az eltéréssel, hogy 0,5 tőmeg/térfogat% kalciumacetát helyett 5 tömeg/térfogat% hidroxilapatitot (BDH) használunk. Az eredményeket a ül. táblázat mutatja. A in. táblázatból látható, hogy az oldatban a kalcium-foszfát-gél képzésére adagolt kalcium-acetáttal ellentétben a hidroxil-apatit adagolása kevésbé hatékonyan távolítja el az endotoxint, és a fenti pH-fiiggés megfordul. 6 m. táblázat pH endotoxin-endotoxin Ha-titer tartalom eltávolítás (%) mértéke (ng/ml) (%) (HAu/ml) kezelés előtt 334000 — 3000 6,0 160000 52,1 3000 7,0 195000 41,6 3000 8,0 264000 21,0 3000 9,0 294000 12,0 3000 1. példa Az 1. referencia példa szerinti módon kapott I extraktumokat (kontrollcsoport) és az I extraktum 04 tömeg/térfogat% kalcium-acetáttal az 1. referencia példa szerinti módon történt kezelése után kapott anyagot azonos térfogatú telített vizes ammónium-szulfáital keverjük, és az elegyet 4 'C-on 7 napig állni hagyjuk. Az ammónium-szulfáttal kicsapott anyagot 10000 fordulatiére sebességgel 20 percig centrifugáljuk, és az üledéket összegyűjtjük. Ezután az oldat téfogatára számítva 1/300 térfogatnyi 1 mól/1 nátrium-klorid—0,05 mól/1 foszfát puffot (pH= 8,0) adagolunk. Alapos elkeverés után az elegyet 1 mól/l-es nátrium-klorid oldattal (pH= 8,0) szemben dializáljuk. A dializátumot szacharóz gradiens centrifugálásnak vetjük alá a következő feltételek mellett: szacharóz sűrűség grádiens= 1-30 tömeg%, R max= 69400 G, idő= kb. 18 óra. A kalcium-foszfát-géles töltet mennyiségét megduplázzuk a kontroliéhoz képest. Centrifugálás után 34 tömeg% szacharóz oldatot töltünk a rotorba a frakeionálás érdekében. Az így kapott frakciókat vizsgáltuk FHA tartalomra ELISA- módszenel és FT és ET-tartalomra az 1. referencia példa szerinti módon. Az eredményeket az 1. és 2. ábra mutatja. Az ábrán a FHA-, PT- és NT-tartalmat - O—, -A- és -v- jellel jelöltük. Az 1. és 2. ábrából kitűnik, hogy annak ellenére, hogy a kalcium-foszfát-géles töltet mennyiségét megdupláztuk, a védőfrakció (FHA, PT) elválasztása az endotoxintól sokkal élesebb, mint a kontroliminták esetén. A kalcium-foszfát-géles minták és a kontrollminták esetén a FHA-ben gazdag és ET-ben változó rakétákat összegyűjtjük, és protein-nitrogén-tartalmakat körülbelül 50 pg/ml értékre állítjuk be. Ehhez 0,02 tömeg/térfogat% zselatint, 0,05 tömeg/térfogat% Tween 80-at és 0,4 térfogat% formaldehidet adagolunk, és az elegyet 39 'C-on néhány napig inkubáljuk. A kapott toxoidos folyadékot dializáljuk, és meghatározzuk az ET-tartalmat. Az eredményt a IV. tábláuzat mutatja. Az ET-tartalmat lhnulus lizátum módszerrel határozzuk meg (Wako Pure Chemical kit), standardként E. coli endotoxint alkalmazunk (Difco 055-B5). AIV táblázatból látható, hogy a vakcinaként alkalmazható pertussis toxoid törzsoldat (protein-nitrogén-tartalom 10 |ig/ml) ET tartalmával összehasonlítva a kalcium-foszfát-géles minta ET-tartalma kevesebb mint 1/40-ed részére csökken. Akontrollmintákban. HU 200 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
