200194. lajstromszámú szabadalom • Eljárás pertussis endotoxin eltávolítására
HU 200 7 8 IV TÁBLÁZAT Kísérlet foszfát minták endotoxin tartalom foszfát minták endotoxin eltávolítás kontroll minták endotoxin tartalom kontroll minták endotoxin eltávolítás 1. 0,3 ng/ml (0,06ng/ml) 99,99994% 19,0 ng/ml (3,8 ng/ml) 99,99591% 2. 0,3 ng/ml (0,06 ng/ml) 99,99988% 12,8 ng/ml (2,6 ng/ml) 99,999458% A zárójelben megadott értékek a 10 mg/ml protein-nitrogénre vonatkoztatott endotoxin-tartalmat mutatják. 2. példa Levine eredeti módszere szerint (Reo Levine, Joseph L. Stone and Louise Wyman: Factors affecting the efficiency of die aluminium adjuvant in diphtheria and tetanus toxoids. J. Immunology 25.301-307, 1955) két adott pertussis toxoid tűrzsoldatot 1/250 mól/1 foszfát-pufferes sóoldattal (pH= 7,0) hígítunk, így a protein-nitrogén-tartalom 10 pg/ml lesz, majd alumínium-kloridot adagolunk 0,18 tömeg/térfogat% végsó koncentrációhoz. Az elegyet jól elkeverjük, és apH-ját sósavval vagy nátrium-hidroxiddal 7,0 értékre állítjuk. így 0,2 mg/1 alumíniumon adszorbeált vakcinát állítunk eló. A vakcina fő tulajdonságai a következők: pH= 7,0, nyúl-pirogenitás: negatív; egér tömegcsűkkenés: 10 BWD-egység/ml vagy ennél kevesebb; egér leukocita fokozódás: 0,5 LP-egység/ml vagy kevesebb; egér hisztamin érzékenység: 0,8 HS-egység/ml vagy kevesebb; pertussis toxoid aktivitás: 8 nemzetközi egység/ml vagy több. Tehátmindkétadatkielégítia Standard of Biological products helyen meghatározott standard értékeket SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás endotoxin eltávolítására Bordetella pertussis I fázisú törzs fertőzés elleni fratóióját és endotoxint tartalmazó folyadékból zóoacentrifugálással, azzal jellemezve, hogy a zónacentrifugálás előtt a folyadékban 4 *C és szobahőmérséklet közötti hőmér-15 sékleten 6,5 és 9 közötti pH-értéken 0,01-0,1 miQimólekvivalens/ml kalcium-foszfát-gél csapadékot képezünk fokozatosan — mimellett a foszfátionok 1,25-30-szoros mólekvivalens fölöslegben vannak a kalciumionokhoz viszonyítva — majd a kapott csa- 20 padékot elkülönítjük. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kalciumionra vonatkoztatva 1,5-7,5 mólekvivalens foszfátiont alkalmazunk. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemez-25 ve. hogy kalciumion-forrásként kalcium-acetátot vagy kalcium-kloridot alkalmazunk. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy csapadékként 0,02-0,07 millimólekvivalens/ml kalcium-foszfát-gélt képezünk. 30 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a csapadékotfokozatosan, a hőmérsékletnek 4 'C-ról szobahőmérsékletre és a pH-értéknek 6,5-ről 9 értékre történő emelésével, 20 perc és 2 óra közötti idő alatt képezzük. 35 6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kalcium-foszfát-gélt ügy képezzük, hogy Bordetella pertussis I fázisú törzs fermentlevének felülúszójából ammónium-szulfátos frakcionált kicsapással kapott csapadékot 1 mól/1 nátrium-klorid — 40 005 mól/1 foszfát puffenel oldjuk, majd kalciumacetátot adagolunk 0,1-1,0 tömeg/térfogat% végső koncentrációig 6,5-9 pH értéknél, és a kapott elegyet 20 perc és2óra közötti idő alatt 4 ’C-ról szobahőmérsékletre hagyjuk melegedni. 45 7. A 6. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a kalcium-acetát végső koncentrációját 0,2 és 0,6 tömeg/térfogat% közötti értékre állítjuk be. 50 55 60 65 5
