200093. lajstromszámú szabadalom • Eljárás tumorellemes gyógyászati készítmények előállítására
17 HU 200093 B 18 ben visszanyerik eredeti térfogatukat. Ez utóbbi regulációs folyamatot mind az R24571, mind a CDM mikromolos koncentrációkban teljesen felfüggeszti. A CDM fél-maximális gátlást kiváltó koncentrációja 1-2 umol/1 kőzőttinek adódott, az R24571-re ez az érték 0,5- -1,0 umol/1 közötti volt (a kísérleteket fehérjementes puffer-oldatban végeztük, ez magyarázza az alacsony Ki értéket). A fenti kísérleteket frissen szeparált perifériás vér limfocitákkal is elvégeztük, és teljes mértékben hasonló eredményeket kaptunk. A térfogat-szabályozás gátlását demonstráló eredmények ismét hangsúlyozzák a CDM kalmodulin-antagonista, illetve kalcium-függó folyamatokat gátló hatását. Az eredmények összefoglalása A CDM kifejezett anti-kalmodulin hatással rendelkezik. Az adott kísérleti rendszerben, a vörösvérsejt-membrán kalmodulin-függá kalcium pumpájánál, a fél-maximális gátláshoz szükséges CDM koncentrációja 5,5 ± t 0,3 jumol/1, mig a bazális kalcium transzport gátlása csak 100 umol/1 felett jelentkezik. Ismert kalmodulin antagonists vegyületekkel összehasonlítva a CDM igen hatékonynak mutatkozott. A CDM kalmodulin-gátló hatása specifikus, hiszen a proteolitikusan aktivált kalcium pumpát csak jóval magasabb koncentrációban gátolta, mint a kalmodulin-aktivált rendszert. A CDM kalmodulint gátló hatása nagyobb mennyiségű kalmodulin adásával visszaszorítható, ennek alapján feltételezhető, hogy a CDM hatása a kalmodulinnal alkotott inaktív komplex képződésén alapul. A CDM hatását szérum albumin jelenléte nem befolyásolja, viszont egyéb szérurafehérjék hatását csökkentik. A CDM gátolja a trombociták és limfociták hipoozmotikus térfogat-szabályozását. A CDM a Mg-függó ATP-áz aktivitást nem, a Na,K-függó ATP-ázt pedig csak magas koncentrációban (200 umól/1) és kismértékben gátolja. A CDM kalmodulin antagonists hatásának a jelentősége A kalmodulin antagonistahatás nemcsak a művileg előállított IOV-ken észlelhető, hanem intakt, élő sejteken (limfociták, trombociták) is, mely közvetve a kalmodulin-függő térfogat-szabályozást gátló effektussal igazolható. A fentiekben idézett irodalmi adatok utalnak mind az intracelluláris Ca2* szint, mind a kalmodulin szerepére a sejtosztódás regulációjában. Számos adat van arra vonatkozóan, hogy a malignusan transzformálódott sejtekben a kalmodulin mennyisége és ezáltal a kalmodulin dependens fehérje-foszforiláció is megnövekedett, mely a sejtosztódás regulációjának a zavarát eredményezi. Mindezek alapján a CDM in vitro és in vivo észlelt sejtosztódás-gátló hatása részben a kalmodulin-antagonista effektusával is magyarázható. A CDM trombocita aggregáció gátló hatása A metasztázis létrejöttének feltételei közé tartozik, hogy a keringésbe jutott tumor sejteket ne pusztítsa el az immunrendszer, valamint az, hogy a tumorsejtek képesek legyenek megtapadni a különböző szövetekben. Ezen folyamatokat elősegíti a tumorsejtek felszínén levő fibrin, vagy egyéb alvadási faktorok, melyhez trombociták és egyéb alakos elemek csatlakoznak. Az igy kialakult tumorembolus a keringésben védelmet nyújt az immunrendszer sejtjei ellen. A trombocita aggregációt gátló anyagok, pl. a prosztaciklinek ily módon a metasztázis képződést gátolhatják. Honn K. V. és munkatársai, Biochem. Pharmacol. 32, 1-11. (1983). 14th Int. Cancer. Congr., Budapest, 1986. Lipton, A. No. 2236; Muszbek, L. No. 2231; Gastpar, H. No. 2232; Zacharski, L. R. No. 2234; Kwaan, H. C. No. 2235. Vizsgálati módszer Az emberi trombociták in vitro aggregációját és ATP kiválasztását Chrono-Log lumiaggregométerrel vizsgáltuk (Model 460, PICA). A 200.000 sejt/ul saját plazmában szuszpendált trombocitákat (PRP) 37 °C-on inkubáltuk folyamatos keverés mellett, majd az aggregációt különböző ágensekkel: 10 uM ADP-vel; 0,1 U/ml trorabinnal (SIGMA); 2 jug/ml kollagénnel; 200 nM forbol-mirisztát-acetáttal (PMA); illetve 10•* M vég koncentrációjú A23187 kalcium ionofórral váltottuk ki. Az aggregációt jelző abszorbancia-csökkenés maximális értékét és sebességét egyaránt értékeltük. Az ATP kiválasztást luciferin-luciferáz (SIGMA) enzimrendszer lumineszcenciája révén mértük. A mintákhoz 1 mg/ml luciferin-luciferázt adtunk, amelynek ATP-specifikus lumineszcenciáját kalibrációs görbével határoztuk meg. Az aggregációs és ATP kiválasztási görbéket párhuzamosan, azonos mintából, kétirófejes rekorderrel rögzítettük. A CDM hatását 2 perces elóinkubálást követően vizsgáltuk puffer-oldatban (137 raM NaCl, 5 raM KCl, 2 mM CaCh, 1 mM MgCb, 5 mM HEPES -pH 7,4-, 5,5 mM glükóz). Eredmény Frissen levett vérből izolált, saját plazma-médiumban a CDM önmagában trombocita aggregációt nem okoz, ugyanakkor jelentősen 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 11
