200093. lajstromszámú szabadalom • Eljárás tumorellemes gyógyászati készítmények előállítására
19 HU 200093 B 20 gátolja számos aggregáló ágens hatását. A CDM erősen csökkenti az aggregáció sebességét és a kialakuló maximális aggregáció mértékét, ugyanakkor nem befolyásolja a kezdeti gyors szakaszt, amely a trombociták alakvál- - tozásával korrelál. Az aggregáció maximális értékét 50%-ra csökkentő drog koncentrációkat három különböző aggregálószerrel végzett kisérlet alapján állapítottuk meg. Trombint, ADP-t, vagy kollagént alkalmazva aggregáló ágensként a CDM saját plazma médiumban 50-100 umol/1, míg plazma fehérjementes pufferben 5-15 umol/1 koncentráció-tartományban okozott félmaximális aggregáció-gátlást, A fehérjementes közegben kifejtett hatás mértéke jól egyezik a kalmodulin antagonists hatás 5,5 ± 0,3 umol/1 Ki-értékével. Két ismert kalmodulin-antagonista hatású vegyület aggregáció-gátló hatékonyságát hasonlítottuk össze a CDM-mel. A Kalmidazolium R24571 (SIGMA) a CDM-nél hatékonyabb, mig a Trifluoperazin (TFP, SIGMA) a CDM-mel közel azonos gátló hatást fejt ki. Fehérjementes pufferban a CDM magas koncentrációi - 200 umol/1 felett - önmagukban is aggregáló hatással rendelkeznek. A trombocita aggregációval párhuzamosan az ATP kiáramlást is vizsgáltuk. Normál körülmények között a trombociták aggregációját ADP, ATP, szerotonin és egyéb tárolt anyagok kiáramlása követi, amelynek fiziológiás jelentősége elsősorban a trombocita aggregáció és a véralvadás folyamatára gyakorolt pozitív visszacsatolás jellegű hatásban van; és újabb trombociták aggregációját indítja el. Kísérleteinkben ATP-érzékeny lumineszcens enzimrendszerrel, a luciferin-luciferáz komplex reakciójával követtük az ATP kiáramlást. 100 umol/1 CDM mind az aggregáció, mind az ATP kiáramlást teljes mértékben gátolta. A CDM, az R24571 és trifluoperazin (TFP) hasonló koncentrációkban eredményezte az ATP kiáramlás gátlását, mint az aggregáció gátlását. Összefoglalva, a CDM hatékonyan gátolja a trombocita aggregáció és az ATP kiáramlás folyamatát. Ez a gátló hatás csökkenti a tumorsejt embolusok kialakulásának a lehetőségét, Így kisebb a metasztázis képződés valószínűsége. A CDM protein kinéz C és sejtmembrán lipidek anyagcseréjének gátló hatása A sejtosztódást illetve differenciálódást kiváltó különböző faktorok a sejtmembrán receptorain keresztül fejtik ki hatásukat. A folyamatok egyik lehetséges útja a protein kináz C aktiválódása és ezzel együtt a sejten belüli Ca2' szintváltoztatása. Ezen történésekben jelentős szerepet játszanak a sejtmembránban levő foszfoinozitidek. A foszfatidil inozitol monofoszfát (PlP)-ból képződő foszfatidil-inozitol 4,5 bifoszfát (PIP2) a specifikus receptor hatásra elbomlik inozitol 1,4,5-trifoszfáttá (IPs) - mely közvetlenül váltja ki a Ca2‘ szignált - és diacil-glicerollá (DAG) - mely a protein kináz C aktivátora. A malignus transzformáció során kimutatható a foszfoinozitidek anyagcseréjének aktiválódása. Ezen anyagcsere-folyamatok gátlása az osztódás gátlásához és egyben a differenciálódás elősegítéséhez vezetnek. Nishizuka, Y., Nature, 308, 693-697. (1984). Nishizuka, Y., J. Natl. Cancer Inst., 76, 363- -370. (1986). Berridge, M. J., Biochem. J., 220, 345-360. (1984). Nishizuka Y., Science, 233, 305-312. (1986). Berridge, M. J. és Irvine, R. F., Nature, 312, 315-321. (1984). 1. ) A CDM protein kináz C gátló hatása a trom bocitákban Módszer: lásd a .Trombocita aggregáció-gátlásnál' Eredmény A CDM különösen hatékonyan gátolja a tumorképződést elősegítő forbolészterrel (Forbol-mirisztát-acetát (PMA) kiváltott trombocita aggregációt. A PMA-ról ismert, hogy a Ca2* és lipid függő protein kináz C aktiválásán keresztül fejti ki hatását. (Nishizuka, Y., Nature, 308, 693-698. (1984). A PMA hatására egy 47-48 kDA molekulatömegű fehérje foszforilációja fokozódik - ez trombocita membrán esetén a protein kináz C ismert szubsztrátja (Kaibuchi, J. Biol. Chem., 258, 6701-6704 (1983). Ezt a foszforilációt a CDM erősen gátolja, ami a CDM protein kináz C aktivitást gátló hatását bizonyltja. 2. ) A CDM proteinkináz C gátló hatása részlegesen tisztított enzimen Protein kináz C tisztítása Az enzimet frissen leölt nyúl agyának kivonatából részlegesen tisztítottuk DEAE cellulóz kromatográfia segítségével, a korábban publikált módon (ref. 1.). Az intakt protein kináz C megőrzésére fenilmetilszulfonil fluorid és leupeptin proteáz- gátlókat használtunk. A cAMP dependens protein kináz disszociált katalitikus alegységének tisztítása A disszociált katalitikus alegységet nyúl vázizmából tisztítottuk részlegesen, egymást követő DEAE-cellulóz és foszfocellulóz kroraa-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 12
