200093. lajstromszámú szabadalom • Eljárás tumorellemes gyógyászati készítmények előállítására
11 HU 200093 B 12 írtak (7) szerint végeztük el. Röviden: a TKD puffert, MnCh-t, Triton-xlOO-at és timidin trifoszfátot tartalmazó reakcióelegyet poli(rA)(dT)ií templát primerrel inkubáltuk a vírus jelenlétében. A szürókorongra TCA-val kicsapott szintetizálódott DNS radioaktivitását scintillációs számlálóval határoztuk meg. Immunfluoreszcencia: A sejtek vázát - a citoszkeletont - felépítő actin filamentumok épségét, ill. megváltozását a normális, a transzformált és a CDM-mel kezelt sejtekben indirekt immunfluoreszcenciával mutattuk ki. A sejteket vékony, kór alakú fedőlemezre növesztettük, majd anti-aktin nyúl szérummal inkubáltuk 37 °C-on, 40 percig. Alapos mosás után a minták egy részét második antitestként fluoreszceinnel, más részét rodaminnal konjugált anti-nyúl kecskeszérummal inkubáltuk az előzőkhöz hasonló módon. A második antitest konjugáció után a mintákat fluoreszcens mikroszkóppal ultraibolya fényben vizsgáltuk. Toxicitási vizsgálat: Tenyésztóedényben lévő IQ6 számú, kétnapos QL fibroblaszt sejtkultúrákat kezeltünk egyidöben DMSO-ban oldott CDM különböző koncentrációival. Az egyes edényekhez 1 ml térfogatban adtuk hozzá a vegyület hígításait. 48 óra múlva sejtszámolást végeztünk, ill. megállapítottuk a sejtek viabilitását. A toxicitási vizsgálat (2. ábra) azt mutatja, hogy a CDM 103, 104 és 105 hígításai erősen toxikusok, mivel jelentősen csökkentették az élő QL sejtek számát, ill. viabilitásukat. Még a 106 hígítás alkalmazása után is sejtszám csökkenést kaptunk, habár ez nem volt jelentős. Lényegesen nem csökkent a sejtszám és a viabilités 107 és e feletti hígításoknál, tehát ezek tekinthetők a biztosan nem toxikus dózisoknak QL sejtek esetében. Proliferáció-gátlás Vizsgáltuk a CDM hatását a gyorsan proliferálódó, transzformált QL sejtek szaporodási kinetikájára. A kezeletlen sejtek száma másodnaponként megkétszereződött. A CDM különböző koncentrációi erősen befolyásolták a sejtszaporodást. A IQ7 higitás a szaporodás-kinetikai görbe jellegét nem változtatta meg, de a kezeletlen sejtekhez képest azonos sejtszám csak későbbi időben keletkezett. Érdekes a 10® higitás hatása. A sejtek lényegesen lassabban kezdtek osztódni, de ez az intenzitás állandó volt, a 6. naptól kezdve pedig fokozódott, és a 8. napon megközelítette az előző hígításnál kapott értéket. Ehhez képest teljesen ellenkező hatást váltott ki a 105 higitás adagolása. Itt is előbb lassú szaporodás indult meg, de ez már a 4. napon megtorpant és a sejtszám ettől kezdve csökkent. A 104 hígításnál az előbbi jelenség már a második napon bekövetkezett. 8 A DNS szintézis intenzitása A DNS szintézis intenzitását a kezeletlen és kezelt sejtekben egy radioaktív nukleozidnak, a timidinnek - az osztódó sejtekbe való beépülésével mértük. Egyre fokozódó beépülést tapasztaltunk a kezeletlen sejteknél. A beépülés intenzitásának növekedése csak az 6-6. napon mérséklődött. A 107 hígításnál változó mértékű, hol növekedő, hol csökkenő beépülést észleltünk, ami azonban végeredményben lassú növekedést mutatott. A 106 higitás a DNS szintézis intenzitását kisebb mértékben, a 105 higitás igen jelentős mértékben csökkentette a QL sejtekben. Reverz transzkriptáz assay A CDM-nek a sejtosztódásra, a DNS szintézis intenzitására való hatása mellett azt is vizsgáltuk, hogyan befolyásolja a vegyület a QL sejtek által termelt daganatvírusok szaporodását. A megjelölt napokon a sejtkultúrák tápfolyadékaiból mintákat vettünk és a daganatvírusokra jellemző reverz transzkriptáz enzim aktivitását mértük. A CDM 107 hígítása csökkentette ugyan az enzimaktivitással arányos víruskoncentrációt a kezeletlen sejtekhez képest, de az adott időpontokban mért értékek emelkedő tendenciát mutattak. Alacsony kezdeti szintről a 10® hígítás esetében is növekedés indult meg, de ez a 6. napon (a 3. mérési sorozatban) visszaesett, s erősen. csökkent viruskoncentrációt eredményezett. A 105 higitás a vírusszaporodást teljesen meggátolta, a 6., 8. napokon nem kaptunk enzimaktivitást. A citoszkeleton aktin filamentumainak változása A magasabbrendű sejtek váza a citoszkeleton, amely a sejtek citoplazmájában lévő fehérjefonalak komplex hálózata. Fő alkotó elemeik az actin-filamentumok, ezek jelenlétét, ill. változásait vizsgáltuk normális és daganatvirussal transzformált, ill. CDM-mel kezelt fibroblaszt sejtekben. A normális fibroblasztokban erőteljes, rendezett kötegeket alkotó, a citoplazma teljes egészére kiterjedő határozott aktin kötegeket figyelhetünk meg. A daganatvirussal transzformált sejtek egész morfológiai megjelenése különbözik a normálistól. Bennük az aktin filamentumok felrostozódtak, csomókban, rendszertelenül, irányultság nélkül helyezkednek el, a citoplazma egy részén találhatók, vagy sok helyen nem is ismerhetők fel. A CDM kezelés után a sejtek ismét határozott morfológiai megjelenésúek, nyúlványokkal rendelkeznek, és a korábban csomókká töredezett aktin részecskék filamentumokká rendeződnek. Ezek irányultsága azonban még nem olyan erőteljes, mint a normális sejtekben. Lényegében hasonló folyamat figyelhető meg, ha fluoreszcein he-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
