200093. lajstromszámú szabadalom • Eljárás tumorellemes gyógyászati készítmények előállítására
13 HU 200093 B 14 lyett rhodamínnal festettük meg a cítoszkeleton filamentumait a teljesebb demonstrálhatóság kedvéért. A CDM gyógyászati hatását Németh-Kellner lymphoma (NKL) tízszeres higitási sorozatával fertőzött svájci fehéregereken vizsgáltuk. Az egereket az NKL hígításával és ezzel egyidejűleg a CDM-mel oltottuk be. Az állatokat a kísérlet folyamán még további őt alkalommal kezeltük a CDM anyaggal. A kontrollcsoport az NKL higitási sorát kapta, azonban más kezelést nem végeztünk. A CDM-mel kezelt, és kontrollállatok átlagsúlyát a kísérlet során 6 alkalommal hasonlítottuk össze. A CDM-mel kezelt állatok átlagsúlya a 16. napon a kontroliokénál 8- -27%-kal volt alacsonyabb. A 18. napon az állatokat leőltük és felboncoltuk. A higitatlan NKL-lel (50 millió sejt/állat) kezelt egereknél a CDM nem gátolta a tumorképződést. Az 5 x 106, 5 x 105, 5 x 104, illetve kevesebb sejttel inokulált csoportoknál a CDM sorrendben 20, 80, illetve 100%-os védelmet nyújtott. A CDM Kalmodulin antogonista hatása A kalmodulin sokfunkciós fehérje, számos alapvető folyamatot szabályoz, központi szerepe van a sejten belüli kalciumszint, mint intracelluláris .második messenger' működésében. Így meghatározó a szerepe a sejtanyagcserében, a hormon-hatások továbbitásában, a normál, valamint a malignusan transzformált sejtek osztódásának és a sejt-sejt kapcsolatok (gap-junction) szabályozásában, valamint a tumorprevencióban. M. L. Veigl és munkatársai, Biochimica et Biophysics Acta, 738, 21-48. (1984.) Klee, C. B. és munkatársai, Ann, Rev. Biochem., 49, 489-515. (1980). Cheung, W. Y., Science, 207, 19-27. (1980). Watterson, D. M. és munkatársai, Ann. N. Y. Acad. Sei. Vol., 356 (1980). Sarkadi, B. és munkatársai, Haematológia, 14, 121-136. (1981). Criss, W. E. és munkatársai, Fed. Proc., 41, 2289-2291. (1982). Currah és munkatársai, Int. Cancer Congr. Bp. 1986. No. 3001. Hirosi Ito, Cancer Letters, 19, 215-220. (1983). Wai Yiu Cheung, Science, 207, 4 (1980). Trosko és munkatársai, Calmodulin antagonist Anal. Cellular Physiology, Acad. Press. Inc., 100- -115. (1985). Whitfield, J. F. és munkatársai, 97-130., Dowden, Hutchingen and Ross., Inc., Stroudsberg (1976). Tupper, J. T. és munkatársai, J. Cell. Phys., 104, 97-103. (1980). Lichtman, A. H. és munkatársai, Blood, 61, 413-422. (1983). Klee, C. B. és munkatársa, Adv. Protein Chem., 35, 213-321. (1982). Lee, Jae Seung és munkatársai, IRCS Med. Sei., 13, 1241-1242. (1985). Kaba Keizo M. D. és munkatársai, J. Neurosurg., 63, 905-911. (1985). Reznik, M. Vivian és munkatársai, IRCS Med. Sei., 14, 209-210. (1986). Lönn Ulf és munkatársa, Int. J. Cancer, 39, 638-642. (1987). A kalmodulin-függő, illetve -független kalcium transzport komponensek mérésével megbecsülhető a kalmodulinra ható vegyületek specificitása illetve toxieitása is. Ezen vizsgálatra igen jól alkalmazható kísérleti rendszer az ún. kifordított vörősvérsejt-membrán vezikula (inside-out vesicle, IOV) preparátum, ahol a vezikulák ATP + + Mg2* -függő kalcium felvételt mutatnak, amelynek sebességét kalmodulin hozzáadása jelentősen fokozza; lásd Gopinath, R. M., Vincenzi, F. F., Biochem. Biophys. Res. Commun., 77, 1203-1209. (1977). Sarkadi, B., MacIntyre, J. D., Gardos, G., FEBS Letters, 89, 78-82. (1987). Scarff, O., Foder, B., Biochim. Biophys. Acta, 509, 67-77. (1978). Az ismert kalmodulin antagonists vegyültek ezt a kalmodulin-függő kalcium felvételt gátolják, a kalmodulinnal inaktív komplexet képezve felfüggesztik annak hatását; lásd Vincenzi, F. F., Cell Calcium, 2, 387-409. (1981). Roufogalis, B. D., .Calcium and Cell Physiology', Marme, D. ed., Springer Verlag, Berlin, 148-169. (1985). Sarkadi, B., Enyedi, A., Nyers, A., Gardos, G., Ann. N. Y. Acad. Sei., 402, 329-348. (1982). A CDM kalmodulin antagonists hatását a következőképpen vizsgáltuk: Módszerek 1. Kifordított vörösvérsejt-membrán vezikulák (IOV-k) preparálása A vezikulákat frissen vett emberi vörősvérsejtekből Sarkadi és munkatársai szerint [Biochim. Biophys. Acta, 598, 326-338. (1980)] készítettük. 2. Aktív kalcium transzport mérése A vezikulák aktiv kalcium felvételét 4SCa izotópos módszerrel követtük [Sarkadi és munkatársai, Biochim. Biophys. Acta, 598, 326-338. (1980)]. A vezikulákat 40-50 jug f«hérje/ml koncentrációban 37 °C-on 120 mM KCl-t, 20 mM HEPES-t (pH = 7,0), 0,5 mM ATP-t, 1 mM MgCht és 50 mM CaCl2-t (benne nyomjelző mennyiségű 45Ca izotópot) tartalmazó médiumban inkubáltuk. A médiumhoz kalmodulint, CDM-t, illetve kalmodulin anta-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 9
