200093. lajstromszámú szabadalom • Eljárás tumorellemes gyógyászati készítmények előállítására
21 HU 200093 B 22 tográfiák segítségével. A tisztítás a korábban publikált módon (ref. 2.) történt. A protein kinéz C aktivitásának mérése A protein kináz C katalitikus aktivitását az általunk kidolgozott rendszerben (ref. 1)3,4.) mértük. Az enzimaktivitás mérésének alapja a protein kináz C azon képessége, hogy az ATP gamma-helyzetű foszfát-csoportját átviszi egy specifikus szubsztrátjának tekinthető nonapeptid, az Ala-Ala-Ala-Ser-Phe-Lys-Lys-amid szerin oldalláncára. (A nonapeptidet mi szintetizáltuk.) A mérés lényege a (-MP)ATP-ból a protein kináz C hatására a nőnapéptidbe épülő 32P radioaktivitásának mérése. A reakcióelegy összetétele (400 m1 végtérfogatban) 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) 10 mM MgClz 0,01 mM (32P)ATP (kb. 300000 cmp per reakcióelegy) 0,7 mg/ml nonapeptid 1,25 mM ÇaCh 20 Mg/ml foszfatidilszerin 25 ng/ml fórból 12-mirisztát 13-acetát az alkalmazott protein kináz C preparátum aktivitása 70-100 pmol transzferált foszfát/perc. A CDM higitási sorokat abszolút alkoholban készítettük, az enzimek inkubációs elegyébe (400 m1) 10 Ml térfogatú alkoholos CDM oldatot vittünk és a CDM nélküli kontroll inkubációs elegyeket 10 m1 abszolút alkohollal egészítettük ki. Az inkubáció 37 °C-on 10 percig folyt, a reakciót jégecettel leállítottuk, a foszforilált nonapeptidet szeparáltuk és a nonapeptidbe épült radioaktivitás mennyiségét Cserenkov effektus alapján mértük. A kapott eredmény mindig 2-2 párhuzamos inkubáció során kapott érték átlagát jelenti. A cAMP-dependens protein kináz aktivitásának mérése A mérés alapjául a (KP)ATP-b01 H2b hisztonba épülő 32P radioaktivitásának mérése szolgált. (A H2b hisztont borjú timuszból preparáltuk.) A reakcióelegy összetétele (400 pl végtérfogatban) 50 mM Tris HCl (pH 7,5) 10 mM MgClí 0,5 mg/ml H2b hiszton 0,01 M (32P)ATP (kb. 300000 cpm reakcióelegy) a disszociált katalitikus alegység aktivitása 60-100 pmol transzferált foszfát/perc volt. Eredmények A CDM 10-50 Mg/ml koncentráció tartományban a protein kináz C gátlószerének bizonyult. Tekintve, hogy a gátlás nem szabályos telítési görbének megfelelő koncentráció-függést mutatott, az 50%-os gátlást okozó CDM koncentrációt csak becsülni lehet, ez az érték 20-25 Mg/ml körül volt. 50 Mg/ml-nél nagyobb CDM koncentrációk gyakorlatilag teljes gátlást idéztek elő. A cAMP-dependens protein kináz disszociált katalitikus alegységének a katalitikus aktivitását ebben a koncentráció-tartományban a CDM nem gátolta észrevehetően. Ennek az enzimnek az aktivitását csak nagyobb koncentrációban gátolta. Az 50%-os gátlás 160 Mg/ml CDM koncentráció körül volt. 1) Romhányi, T., Seprődi, J., Antoni, F., Mészáros G., Buday, L. and Faragó, A. (1986). Biochim. Biophys. Ac ta 888, 325-331. 2) Mészáros, Gy., Enyedi, A., Bánhegyi, G., Mandl, J., Antoni F. and Faragó, A. (1987). Acta Biochim. Biophys. Hung. 22, 7-16. 3) Romhányi, T., Seprődi, J., Antoni, F., Mészáros, G. and Faragó, A. (1985). Biochim. Biophys, Acta 827, 144-149. 4) Buday, L., Seprődi, J., Farkas, Gy., Mészáros, Gy., Romhányi, T., Bánhegyi, G., Mandl, J., Antoni F. and Faragó, A. (1987). FEBS Letters 223, 15-19. 3.) A CDM hatása trombocita membránfehérjék-lipidek foszforilációjára Módszer A membrán komponensek foszforilációját trombocita és vőrösvérsejt-membrán szeparátumokban Sarkadi és munkatársai, valamint Enyedi és munkatársai szerint mértük. (Sarkadi és munkatársai, FEBS Letters, 152, 195- -198. (1983). Enyedi és munkatársai FEBS Letterv, 161, 158-162. (1983). A membránt 32P-ATP jelenlétében inkubáltuk, majd a reakciót triklór-ecetsavval leállítottuk. A kicsapott fehérjéket ATP és Pi tartalmú triklór-ecetsavval háromszor mostuk. A foszforilált fehérjék vizsgálatához az üledéket pufferban vettük fel, majd Laemmli (Nature, 227, 680-685. (1970) típusú gélelektroforézist végeztünk. A foszforilált lipidek vizsgálatához az üledéket kloroform: metanol: sósav-oldatban vettük fel, majd a lipideket a szerves fázisba átráztuk. A jelzett lipideket vékonyréteg-kromatográfián azonosítottuk. A jelzett lipideket illetve fehérjéket autoradiográffal vizsgáltuk. 5 10 15 20 25 30 35 40 15 50 55 60
