200070. lajstromszámú szabadalom • Eljárás napraforgó regenerálására embriogenezissel
5 HU 200070 B 6 aminosavat, szacharózt és egy hormont tartalmaz. A szervetlen sók makroelemek és nyomelemek sói. A makroelemek, nyomelemek, vitaminok és az aminosav ugyanazok, mint az első közegben, azonos koncentrációban, kiegészítő nélkül. A szacharóz előnyösen kisebb mennyiségben van jelen, mint az első közegben, például 2-4%-ban, előnyösen 3%-ban. Az alkalmazott hormon azonos az első közegben alkalmazott hormonnal, 6-benzil-amino-purin. Általában 0,1-05 mg/1 a megfelelő mennyiség. Agart, például Phytagar vagy Gelrite nevű terméket alkalmazunk a közeg megszilárdítására. 0,6% Phytagar vagy 0,3% Gerlite végső koncentráció jó eredményt ad. A közeget a fent leírt módon sterilizáljuk, és pH-ja 5,0-6,3, előnyösen 5,0. A második közegen 2-3 hét után az elkülönített szomatikus embriók kicsíráznak és átalakulnak 2-5 cm-es csíranövényekké. A gyökeret eresztett csíranövényeket át lehet helyezni talajba, tőzeg, vermikulit és finom homok 3:2:1 arányú steril keverékébe, amelyet Jiffy-cserépbe tesszük; a cserepeket nedves homokkal töltött tálba helyezzük és átlátszó polietilén zacskóval betakarjuk a nagy nedvességtartalom fenntartása érdekében, majd az egészet 15 °C-os klimakamrába (6000 lux) helyezzük 12-16 óra, előnyösen 15 óra napi megvilágítási idő alkamazásával. 10 nap múlva a növényeket nagyobb cserepekbe tesszük át és üvegházban neveljük 26 °C-on (40000 lux) napi 12-16 óra, előnyösen 15 óra megvilágítási idő alkalmazásával. Azokat a növényeket, amelyek nem eresztettek gyökeret, beolthatjuk üveghézban nevelt fiatal növényekbe szokásos módszerrel (lásd Habermann, Wallace: Amer. J. Bot., 45., 479, /1958/), vagy 10-20 napra áthelyezhetjük egy gyökerezhető közegbe vagy harmadik közegbe. A harmadik közeg szervetlen sókat, vitaminokat és szacharózt tartalmaz. A szervetlen sók makroelemek és nyomelemek sói. Az ebben a harmadik közegben alkalmazott makroelemeket a következő vegyületekból választhatjuk: magnézium-szulfát, kalcium-klorid, mononátrium-foszfát, kálium-nitrát és ammónium-szulfát. A nyomelemeket tartalmazó sók lehetnek például bórsav, mangán-szulfát, cink-szulfát, nátrium-molibdát, réz-szulfát, kobalt-klorid, kálium-jodid és vas-nátrium-EDTA kelát. A szervetlen sóknak ez a kombinációja B5 néven ismert. A makroelemek és nyomelemek előnyös mennyisége 1 liter közegben a következő: magnézium-szulfát-heptahidrát (250 mg) kalcíum-klorid-dihidrát (150 mg) mononátrium-foszfát--monohidrát (169 mg) kálium-nitrát (3000 mg) bórsav (3 mg) mangán-szulfát- tetrahidrát (13,2 mg) cink-szulfát-heptahidrát (2 mg) nátrium-molibdát-dihidrát (0,25 mg) réz-szulfát-pentahidrát (0,025 mg) kobalt-klorid-hexahidrát (0,025 mg) kálium-jodid (0,75 mg) és vas-nátrium-EDTA kelét (40 mg). A harmadik közeg vitaminokat is tártálmaz. Ezek nikotinsav, tiamin, piridoxin és mio-inozitol. A vitaminok előnyös mennyisége 1 liter közegben a következő: nikotinsav (1 mg) tiamin-hidroklorid (10 mg) piridoxin-hidroklorid (1 mg) és mio-inozitol (100 mg). A harmadik közeg tartalmaz szacharózt, aktív szenet vagy egy auxin-tipusú hormont is. A szacharóz például 1-2%, előnyösen 1%, az aktiv szén 0,1% mennyiségben van jelen. Ha aktiv szén helyett inkább hormont alkalmazunk, 0,1-0,2 mg/1 3-indolecetsav választódik ki. Agart, úgymint Phytagar vagy Gelrite nevű terméket használunk a közeg megszilárdítására. 0,5% Phytagar vagy 0,25% Gerlite végső koncentráció megfelelő. A közeg pH-ja 5,0 és 6,0 között változhat és előnyösen 5,0. A közeget autoklávban sterilizáljuk. A növényeket ezen a közegen 2-3 hétig neveljük 26 °C-on világosban (1500 lux), napi 12-16 órás, előnyösen 16 órás megvilágítási idővel. A növények ezután gyökeret eresztenek és áthelyezhetók talajba. Az ezzel az eljárással kapott növények fenotipusukban különbözhetnek a kiindulási anyagtól, az in vitro stressz következtében. A növényeket kézi munkával porozzuk be és addig tároljuk, amíg a magvakat összegyűjtjük. Néhány magvat eltüntetünk az új napraforgó növények vizsgálatára és az előnyös mutánsok lehetséges kiválasztására, amelyeket azután bevonunk egy változat szelekciós programba. A találmány szerinti megoldást a következő nem-korlátozó példákkal szemléltetjük közelebbről: 1. példa A törzsoldatok elkészítése a) B5 törzsoldat Tízszeres töménységű B5 törzsoldatot úgy állítunk elő, hogy egy zacskó szacharóz nélküli, a B5 közeget (Flow Laboratories gyártmánya, tartalmazza a B5 szervelten sóit, 1 mg nikotinsavat, 1 mg piridoxin-hiodrokloridot, 10 mg tiamin-hidrokloridot és 100 mg inozitolt - végső koncentrációk) föloldunk 5 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
