200070. lajstromszámú szabadalom • Eljárás napraforgó regenerálására embriogenezissel
7 HU 200070 B 8 desztillált és ionmentesített vízben (1000 cm3 végső térfogat). A törzsoldatot 100 cm3-es aliquot részekre osztjuk és -20 °C-on tároljuk. b) 6-benzil-amino-purin ÍBAP) tőrzsoldat 1 g/1 BAP tartalmú törzsoldatot készítünk úgy, hogy 100 mg 6-benzil-araino-purint feloldunk néhány cm3 0,15 n sósavoldatban, az oldatot enyhén melegítjük és desztillált és ionmentesített vízzel 100 cm3-re hígítjuk. Ezt az oldatot 0,2 /uni-es Minisart NML jelű membránszürón (Sartorius gyártmány) szűrve sterilizáljuk, mielőtt hozzáadnánk az első és a második közeghez. c) 3-indoIecetsav (IAA) törzsoldat 0,2 g/1 IAA-t tartalmazó törzsoldatot készítünk úgy, hogy 20 mg 3-indolecetsavat feloldunk néhány cm3 tiszta etanolban, és az oldatot desztillált és ionmentesített vízzel 100 cm3-re hígítjuk. Ezt az oldatot 0,2 ym-es Minisart NML jelű membránszűrön (Sartorius gyártmány) szűrve sterilizáljuk, mielőtt hozzáadnánk a harmadik közeghez. d) Vitamin- és aminosav-kiegészitö Chandler és Beard szerint (Crop. Sei., 23., 1004, /1983/). Húszszoros töménységű vitamin- és aminosav-törzsoldatot készítünk úgy, hogy 39 g mio-inozitolt, 10 g L-alanint, 8 g L-glutamint, 1,6 g L-szerint, 0,5 g L-triptofánt és 0,1 g L-ciszteint együtt feloldunk desztillált és ionmentesített vízben (végső térfogat 500 cin3). A törzsoldatot 50 cm3-es aliquot részekre osztjuk és -20 °C-on tároljuk. 2. példa A közegek előállítása a) Első közeg vagy embrióindukciós közeg A közeget úgy állítjuk elő, hogy egy zacskó szacharóz nélküli Murashige és Skoog közeget (a Flow Laboratories gyártmánya, tartalmazza az MS közeg szervetlen sóit, 0,1 mg tiamin-hidrokloridot, 0,5 mg nikotinsavat, 0,5 mg piridoxin-hidrokloridot, 2 mg glicint és 100 mg inozitolt) és 90-120 g szacharózt feloldunk desztillált és ionmentesített vízben. Adott esetben hozzáadunk 500 cm3 vitamin- és aminosav-kiegészitót, majd pH-ját 0,1 n nátrium-hidroxiddal 5,0-ra állítjuk be, a térfogatot 1 literre egészítjük ki, és 6 g Phytagar (Gibco gyártmány) vagy 3 g Gelrite (Kelco gyártmány) hozzáadása után az elegyet 20 percig autoklávozzuk 68,9 kPa nyomáson. Amikor a közeg langyos, hozzáadjuk a 6 fent leírt módon sterilizát BAP-oldatot (2,2- -4,4 juM; 0,5-1 cm3). A elegyet ezután Petri-csészékbe öntjük. b) Második közeg vagy csíranövény nevelő közeg A második közeget az első közeghez hasonló módon állítjuk elő, együtt feloldva egy zacskó MS közeget, 30 g szacharózt és 6 g Phytagart vagy 3 g Gelrite-et 1 liter vizben, és autoklávozás után hozzáadva a steril BAP-oldatot (0,44-2,2 uM; 0,1-0,5 cm3). A közeget Plantcon-csészékbe (a Flow Laboratories gyártmánya) öntjük. c) Harmadik közeg vagy gyökereztetó közeg A harmadik közeget úgy állítjuk elő, hogy 10-20 g szacharózt adunk a B5 desztillált és ionmentesített vízzel készített tórzsoldatának 100 cm3-éhez. A pH-t 0,1 n nátrium-hidroxid oldattal 5,0-ra állítjuk be, majd az elegy térfogatát 1 literre egészítjük ki és 5 g Phytagart és 1 g aktív szenet adunk hozzá. Autoklávozás után a közeget Masonkannákba öntjük. Ha 3-indolecetsavat is tartalmazó harmadik közeget akarunk használni, az aktív szenet kihagyjuk a harmadik közeg készítése során. Autoklávozás után a langyos közeghez hozzáadjuk a steril IAA-oldatot (0,57-1,11 juM; 0,5-1 cm3). A közeget hasonlóképpen Mason-kannákba öntjük. A harmadik közeg folyékony változata csak a B5 szervetlen sóit és IX szacharózt tartalmaz 5,0 pH-n. Az elegyet 10 ml-es részletekben szűrópapírhidat tartalmazó üvegcsövekbe öntjük Chandler és Beard módszere (Crop. Sei., 23., 1004, /1983/) szerint, majd autoklávozzuk. 3. példa Az éretlen embriókat magházukkal együtt elválasztjuk a napraforgó (Helianthus annuus, T 76 változat) fészekvirágzatoktól, amikor elérik a 0,5-1,5 mm-es nagyságot. A magvakat 20 percig sterilizáljuk Javelle-víz oldatában, amelynek klórmetrikus erőssége 3°, és desztillált vízzel mossuk. Az éretlen embriókat burkuktól elválasztjuk és Petri-csészékbe, az első közegre helyezzük. Az első közeget a fent leírt módon állítjuk elő, 90 g/1 szacharózzal és 0,5 mg/1 (2,2 juM) BAP-pal. A Petri-csészéket sötétben inkubáljuk 3 hétig, hogy serkentsük a szomatikus embriók képződését. Ebben a szakaszban a szomatikus embriókat, amelyek elkezdtek csírázni, elkülönítjük a zigíta embrióktól és a második közegre, Plantcon-csészékbe helyezzük. A második közeg, amelyet a fent leírt módon elkészítet-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
