200070. lajstromszámú szabadalom • Eljárás napraforgó regenerálására embriogenezissel
3 HU 200070 B 4 4-21 naposak; általában 0,1—5 mm méretűek. A nagyméretű éretlen embriókat több egyenlő részre vághatjuk a gemmula-radicula tengelyen át haladó síkok mentén, így megtöbbszörözhetjük az egyetlen embrióból nyert kiónok számát. A találmány szerinti eljárást a következőképpen hajtjuk végre: HA 89, HA 290, HA 291, HA 300, HA 303, T 76, RT 26 és óriás szürke csíkos napraforgó változatokat üvegházban termesztünk (26 °C, 40000 lux, napi 15 órás megvilágítási idő) és ellenőrzött megtermékenyítésnek vetjük alá. Az éretlen embriókat 4-21 nappal a beporozás után eltávolítjuk. A fészekvirágzatokból kiemelt magvakat úgy sterilizáljuk, hogy 20 percre kereskedelemben kapható Javelle-viz oldatába mártjuk, amelynek klórmetrikus erőssége 3°, és amelyhez néhány csepp Tween 80 nedvesitőszert (8-10 mól etilén-oxidot tartalmazó etilén-oxid és nonil-fenol kondenzátum) adtunk, majd steril desztillált vízzel háromszor mostuk. Az embriókat ezután aszeptikus körülmények között elkülönítjük, ha szükséges, feldaraboljuk és az első, úgynevezett embrió-indukciós közegbe helyezzük. Ez az első közeg szervetlen sókat, vitaminokat, arainosavakat, szacharózt és egy hormont tartalmaz a kalluszok képződéséhez megfelelő mennyiségben. A szervetlen sók makroelemek sói és nyomelemek sói. Az ebben az első közegben alkalmazott makroelemeket például a következő vegyületek közül választhatjuk: magnézium-szulfát, kalcium-klorid, monokálium-foszfát, kálium-nitrát és ammónium-nitrát. A nyomelemeket tartalmazó sók közül megemlíthetjük a bórsavat, mangán-szulfátot, cink-szulfátot, nátrium-molibdátot, réz-szulfátot, kobalt-kloridot, kálium-jodidot és a vas-nátrium-EDTA kelétot. A szerves sóknak ez a kombnációja Murashige és Skoog nevén ismert (MS). A makroelemek és a nyomelemek előnyös mennyisége 1 liter közegben a következő: magnézium-szulfát-heptahidrát. (370 mg) kalcium-klorid-dihidrát (440 mg) monoalkáliuin-foszfát-dihidrát (170 mg) kálium-nitrát (1900 mg) ammonium-nitrát (1650 mg) bórsav (6,2 mg) mangén-szulfát-tetrahidrát (22,3 mg) cink-szulfát-heptahidrét (8,6 mg) nátrium-molibdát-dihidrát (0,25 mg) réz-szulfát-pentahidrát (0,025 mg) kobalt-klór id-hexahidrát (0,025 mg) kálium-jodid vas-nátrium-EDTA (0,83 mg) és kelát (36,7 mg). Az első közeg tartalmaz vitaminokat is, úgymint nikotinsavat, tiamint, piridoxint, mio-inozitolt, és egy aminosavat, úgymint alanint, glutamint, szerint, triptofánt, ciszteint vagy előnyösen glicint. A vitaminok és aminosavak előnyös mennyisége 1 liter közegre a következő: nikotinsav (0,5 mg) tiamin-hidrok lórid (0,1 mg) piridoxin-hidroklorid (0,5 mg) inio-inozitol (100 mg) és glicin (2 mg). Az első közeg tartalmaz hat egy vitamin-és aminosav-kiegészítót is, ez a kiegészitó nem alapvetően fontos a szomatikus embriók képződéséhez, de növeli előfordulásuk gyakoriságát. Ebben az esetben a vitaminok és aminosavak előnyös mennyisége 1 liter közegben a következő: nikolinsav (0,5 mg) tiamin-hidroklorid (0,1 mg) piridoxin-hidroklorid (0,5 mg) mío-inozitol (4000 mg) L-alanin (1000 mg) L-glutamin (800 rag) L-szerin (160 mg) L-triptofán (50 mg) L-cisztein (10 mg) és glicin (2 mg). Az első közegben levő szacharóz 8-12%, előnyösen 9% mennyiségben van jelen. Az első közegben levő hormon, amelynek milyensége a találmány egyik jellemzője, citokinin-Lípusú, 6-benzil-amino-purin. Általában 0,5-1 mg/1 közeg a megfelelő hormonmennyiség. Agart, így Phytagar vagy Gelrite nevű terméket használunk a közeg megszilárdítására. 0,6% Phytagar vagy 0,3?'» Gelrite végső koncentráció jó eredményt ad. A közeg pH-ja 5,0-6,3 között mozoghat és előnyösen 5,0. A közeget autoklávban sterilizáljuk, a hormonok kivételével, amelyeket mikroporózus membránon végrehajtott szűréssel sterilizálunk. Az éretlen embriókat, amelyeket erre az első közegre helyezünk, körülbelül 2-3 hétig neveljük sötétben, 26 °C-on. Ez alatt az időszak alatt a zigóta embriók kifejlődnek és szomatikus embriók jelennek meg a sziklevél alatt és a sziklevél belső felületén a HA 291 változat esetében. Ezeket a szomatikus embriókat azután elkülönítjük és áthelyezhetjük a második, úgynevezett csíranövény növekedést biztosító közegre. Az embriogén kalluszt vagy az elkülönített embriókat 2-3 hétig 26 °C-on, világosban (1500 lux) neveljük a második közegen, napi 12-16, előnyösen 16 órás megvilágítási idővel. Ez alatt az idő alatt az embriók kicsíráznak és a képződött csiranövények gyökeret ereszthetnek. Az első közeghez hasonlóan a második közeg szervetlen sókat, vitaminokat, egy 5 10 1.6 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
