200070. lajstromszámú szabadalom • Eljárás napraforgó regenerálására embriogenezissel
1 HU 200070 B 2 A találmány tárgya eljárás napraforgó növény regenerálására sejtekből vagy szövetekből szomatikus embriogenezissel. Bár számos termesztett növényfajta elkülönített sejtjeiből vagy szöveteiből regenerálható a növény, a napraforgóval (Helianthus annus) kapcsolatos ilyen erőfeszítések gyakran eredménytelenek maradtak. Az irodalomban leírnak néhány, a napraforgó szomatikus embriogenezissel végzett regenerálására vonatkozó eljárást, de ezek a módszerek csak ritkán genotípusokra vagy interspecifikus hidridekre vonatkoznak. Az explantátumokat egy első közegben tenyésztik, amely serkenti a kalluszképződést. A kalluszt azután átviszik egy második közegbe, amely serkenti a szomatikus embriók és cslranövények képződését. A csiranövényeket ezután átviszik egy harmadik közegbe, amely serkenti a gyökérképzódést, és a regenerált növényt ebben a szakaszban talajba lehet ültetni. Paterson és Everett (Plant Sei., 42., 125, /1985/) kifejlesztettek egy közeget, amely tulajdonképpen a Georgieva-Todorov és munkatársai (Proc. 9th Int. Sunflower Conference, Torremolinos, Spanyolország, 1980, 122. oldal) által kidolgozott közeg javított formája; ez a közeg indukálja az SS 415 B termesztett napraforgófajta regenerálódását szomatikus embriogenezissel sziklevél alatti fragmensekból. Az explantátumokat 2 hétig tenyésztik sötétben, majd 2-4 hétig világosban módosított Murashige és Skoog (MS) közegen, amely 40 mg/1 adenin-szulfáttal, 1 mg/1 6-benzil-amino-purinnal (BAP), 1 mg/1 naftalin-ecetsvval (NAA) és 0,1 mg/1 gibberelinnel (GAa) van kiegészítve. Az első 2 hét során laza kallusz képződik, majd a fényben zöld foltok tűnnek elő, amelyek hajtásokká alakulnak. Anatómiai vizsgálat azt mutatja, hogy ezek a zöld foltok a zigóta embriókhoz hasonló szomatikus embriók. Chandler és Jan (Agronomy Abstr., 58, /1983/) leírják a napraforgó regenerálását interspecifikus keresztezésekből származó éretlen embriókból. Az éretlen (4-5 napos) embriókat Chandler és Beard által leirt növekedést elősegítő embriónevelő táptalajra (Crop. Sei., 23, 1004, /1983/) helyezik. A megnőtt embriókat 2-3 hét múlva átteszik MS-közeg alapú különböző táptalajokra, amelyek auxint és doxiciklint tartalmaznak változó dózisokban. Ezeken a közegeken a növények különböző módokon hozhatók létre, beleértve a közvetlen csírázást vagy a kallusz indukciót, amelyet organogenezis vagy embriogenezis követ. A legjobb eredményeket 0- -1 ppin közötti indolecetsav (IAA) és kinetin koncentrációval érik el. A rendszer előnye, hogy egyetlen embrióból több kiónt állítanak elő. Cooley és Wilcox a 0172377 számú európai szabadalmi bejelentésben egy olyan, HA 89 és RHA 274 napraforgó változatokra alkalmazott eljárást javasol, amely a fent leirt három szakaszból áll és három különböző táptalajon hajtják végre, amelyek közül az első két szakasz táptalaja szükségszerűen tartalmaz egy auxin-Lipusú hormont. Ennek az eljárásnak azonban több hátránya is van; egyrészt csak olyan embriókkal hajtható végre, amelyek mérete egy szűk tartományba (0,1-2 mm) esik, ezért kevéssé rugalmas, másrészt a közeget cserélni kell az első és a második szakasz között, végül pedig a kapott csiranövények regenerálódási foka még így is igen kedvezőtlen. Találmányunk egy olyan egyszerűbb, napraforgó változatok regenerálására szolgáló eljárásra vonatkozik, amely olyan csíranövényeket eredményez, amelyeknek nagyobb a növekedési kapacitása, ha újra a talajban termesztik őket. Közelebbről a találmány tárgya eljárás napraforgó változatok regenerálására éretlen embriókból- az első szakaszban a sejtekből vagy a szövetekből embriogén kalluszt képezve hormontartalmú indukciós táptalajon tenyésztve,- a második szakaszban az embriogén kalluszokat hormontartalmú táptalajon tenyésztve, így ezek növekszenek, fejlődnek és csíráznak,- egy adott esetben végrehajtott harmadik szakaszban tenyésztéssel lehetőséget adva a növények növekedésére és fejlődésére. A találmány szerinti megoldást az jellemzi, hogy az első két szakaszt azonos jellegű tápközegben végezzük, amely megfelelő mennyiségű G-benzil-amino-purin citokinin-tipusú hormont valamint szacharózt tartalmaz, auxin-típusú hormon távollétében. Leírásunkban a továbbiakban a százalékos értékek tömeg/térfogat értékeket jelölnek, amennyiben mást nem adunk meg. Azok a növényi szövetek, amelyekből a szomatikus embriók előállításához explantátumokat lehet kivenni, a napraforgó (Helienthus annuus) olyan változataiból származnak, amelyeket elsősorban a szelekciós programokban használnak, Az eljárást nyolc változat felhasználósával szemléltetjük; HA 89, HA 290, HA 291, HA 300, HA 303, T 76, RT 26 és óriás szürke csíkos. A HA 89 változat Dade Counts-ból (Florida, USA), a HA 290, HA 291, HA 300, HA 303, T 76 és RT 26 változatok a Seedtec International Inc. cégtől (Woodland, Kalifornia, USA) és az óriás szürke csíkos a Northrup King Seeds cégtől (Fresno, Kalifornia, USA) származik. Az explantátumok üvegházban termesztett növényekből származnak, amelyeket ellenőrzött megtermékenyítésnek vetünk alá. A kalluszok előállítására az előnyösen alkalmazható explantátum az éretlen embrió. Az éretlen embriókat magházukkal együtt elkülönítjük a napraforgó fészekvirágzatoktól amikor 3 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
