199898. lajstromszámú szabadalom • Fermentációs eljárás L-prolin előállítására
1 HU 199898 B 2 Ezen a táptalajon 48 óra alatt és 30 °C hőmérsékleten végezzük a tenyésztést, majd az így kapott egyes kolóniákat vizsgáljuk, hogy a 3. sz. táptalajon szaporodni képesek-e. A 3. sz. táptalaj egyetlen szén- és nitrogénforrásként L-prolint tartalmaz. A 3. sz. táptalaj összetétele 1 ml-re vonatkoztatva: mg L-prohn 10,0 Na-,Sü4 2,0 k2hpo4 3,0 kh,po4 1,0 MgS04.7H->0 0,1 MnS04.5H?0 1.10"* agar-agar pH * 7,4 20,0 A 3. sz. táptalajon szaporodásra képtelennek bizonyuló kolóniákat 96 ógáig 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk, és az 1. példa szerinti módon vizsgáljuk prolintermelő képességüket. Az egyik ily módon kiválasztott mutánst AP 110 Brevibacterium flavumnak nevezzük. Az AP111 Brevibacterium flavum törzs előállítása Az ATCC 14067 törzs mutációnak kitett kultúráját (a mutáció feltételei azonosak az AP110 törzs előállításánál közöltekkel) 2. sz. táptalajra helyezzük, amely 0,5 mg/ml koncentrációban még L-izoleucint is tartalmaz. A táptalajon 48 óra alatt 30 aC hőmérsékleten végezzük az inkubálást, és az így keletkezett kolóniák közül kiválasztjuk azt a mutánst, amely az L-izoleucint tartalmazó 2. sz. táptalajon képtelen volt szaporodásra. Az így kapott izoleucin auxotrófía során keletkező mutánst NG mutációnak alávetjük, és kiválasztjuk azt a mutánst, amely DP-vel és a tápközeg magas ozmózisnyomásával szemben rezisztens. A kiválasztás az AP 110 törzsnél leírtak szerint történik, azzal a különbséggel, hogy az 1. sz. táptalajban 250 mg/ml szacharóz helyett 20 mg/ml glükózt és 28 mg/ml NaCl-t, valamint 0,5 mg/ml L-izoleucint helyezünk. Az így kiválasztott egyik mutánst, amelyik nagy mennyiségben 5 termeli az L-prolint AP111 Brevibacterium flavumnak nevezzük. Az AP 112 Brevibacterium flavum előállítása Az ATCC 14067 törzs izoleucin auxotrófía során keletkező mutánst NG-vel indukáljuk úgy, 10 hogy az AP 111 törzsnél leírtaknak megfelelően ismét NG-vel kezeljük és kiválasztjuk a DP-vel és a 2. sz. táptalaj magas szacharóz tartalmával szemben rezisztens mutánsokat. A kiválasztás az előző törzseknél alkalmazott módon történik az- 15 zal a különbséggel, hogy az 1. sz. táptalaj 0,5 mg/ml l-izoleucint tartalmaz. Az egyik ilyen módon kiválasztott mutánst, amelyik az L-prolint nagy mennyiségben termeli, AP112 Brevibacterium flavumnak nevezzük. 20 Az AP 113 Brevibacterium flavum törzs előállítása Az ATCC 14067 törzsből olyan mutánst nyerünk, amely képtelen az L-prolin lebontására. Ezt az API 10 törzs előállításánál leírtak szerint 25 végezzük. A következő lépésben a kapott L-prolin lebontására képtelen törzsből az AP 110 törzs előállításánál megadott módon egy DP-vel és magas szacharóz koncentrációval szemben rezisztens mutánst állítunk elő. Az így előállított 30 kettős mutánsból, amely képtelen az L-prolin lebontására és amely a DP-vel és a táptalaj nagy ozmózis-nyomásával szemben rezisztens olyan mutánst nyerünk, amely szaporodáshoz L-izoleucint igényel. Az eljárást az AP 111 törzs elő- 35 állításánál megadott módon végezzük. Az egyik ily módon kapott mutánst, amely az L-prolint nagy mennyiségben termeli AP 113 Brevibacterium flavumnak nevezzük. A találmány szerinti megoldásban alkalmazott 40 mutáns törzsek jellemzőit egymáshoz hasonlítva és az ATCC 14067 törzshöz viszonyítva az 1. táblázatban közöljük. 1. táblázat Brevi- Szén és nitrogén Relatív szaporodás, % bacterium forrásként DP mg/ml koncentráció törzs prolit tartalmazó táptalajon tapasztalt szaporodási képesség 0 0,75 1,0 1,5 2,0 ATCC 14067 + 100 13 12 12 8 AP110 (CMPM B-3317) 100 76 67 53 46 AP111 (CMPM B - 3258) + 100 35 30 28 20 AP112 (CMPM B - 3259) + 100 80 79 76 41 AP113 (CMPM B - 3260)-100 64 53 44 31 3
