199898. lajstromszámú szabadalom • Fermentációs eljárás L-prolin előállítására
1 HU 199898 B 2 Az L-prolin lebontási képességet a kövekező módon vizsgáljuk: Az 1. táblázatban közölt törzsek szuszpenzióit felcsepegtetjük a 3. számú agarizált táptalajra és % óra alatt 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk, majd a cseppek körüli zónában megfigyeljük a szaporodást. Ha szaporodást tapasztalunk, akkor ezt " + “ jellel jelezzük, ha nincs szaporodás, a " — " jelet alkalmazzuk. A DP-vel és a tápközeg magas ozmózisnyomásával szembeni rezisztenciát úgy állapítottuk meg, hogy az 1. sz. táblázatban megadott törzseket az 1. sz. folyékony lápközeggel 105 sejt/ml koncentrációban kémcsövekbe töltöttük. Az 1. sz. tápközeg a megadott összetételen kívül még 250 mg/ml koncentrációban DP-t is tartalmazott. AP 111, AP 112 és AP 113 törzsek esetében az 1. sz. tápközeg 0,5 mg/ml koncentrációban L-izoleucint tartalmazott. A kémcsövekben lévő anyagot 24 órán keresztül 30 °C hőmérsékleten levegőztetés közben inkubáltuk, majd meghatároztuk az 540 pm-n a kultúra optikai sűrűségét. Az 1. táblázatban felsorolt jellemző értékek %-os adatok, amelyek DP-t nem tartalmazó 1. számú táptalajon tenyésztett kultúra optikai sűrűségére vonatkoznak. A mutánsokat tartalmazó kultúrafolyadékban az L-prolin olyan tetszés szerinti tápközeg felhasználásával halmozódik fel, amely mikroorganizmusok szaporodását és L-prolin termelődést fokozó asszimilálható szén- és nitrogénforrást, szervetlen és szerves anyagokat tartalmaz. Az L-prolin termelődés aerob körülmények között, igen széles hőmérséklettartományban és pH-tartományban végzett tenyésztéssel történik. Az optimális hőmérséklet 28 - 30 °C. Az optimális pH érték 6,5-8,5. Az L-prolin termelés a fermentálás elkezdésétől számítva 8- 10 óra múlva indul meg. A kultúra folyadékban maximális mennyiségű L-prolint azonban a szén- és energiaforrások teljes mértékű felhasználásával érhetjük el. Az alkalmazott szén- és energiaforrás koncentrációjától függően a fermentálás elkezdésétől számítva ez az idő 36 óra vagy több. A kultúrafolyadék L-prolin-tartalma azatin színezéssel és papírkromatográfiával meghatározható. A termelődött L-prolint a kultúrafolyadékből tetszés szerinti ismert eljárással elválasztjuk, így Eéldául a baktériumokat és az oldhatatlan részeet átfolyós centrifugálással vagy szűréssel eltávolítjuk, majd a leülepedett és összegyűlt L-prolint ioncserélőgyantán eluáljuk, koncentráljuk és kikristályosítjuk. A találmány szerinti eljárást a következő példákkal szemléltetjük: 1. Példa 250 ml-es fermentáló lombikokban 10 -10 ml sterilizált fermentáló tápközeget helyezünk. A tápközeg összetétele 1 liter térfogatra számítva a következő: szacharóz 150,0000 (NH4)2S04 55,0000 kh2po4 1,0000 MgS04.7H20 10,0000 CaC03 50,0000 FeS04.7H20 0,0100 MnS04.5H20 0,0100 ZnS04.7H20 0,0100 biotin 0,0005 tiamin-klorid pH = 8,0 0,0005 A lombikban lévő táptalajt AP 110 Brevibacterium törzzsel fertőzzük és egy ingaszerűen mozgó berendezésben 72 óra alatt, 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk. Az inkubálás után kapott kultúrfolyadékban az L-prolin koncentrációja 40,5 g/1. Azonos körülmények között ATCC 14067 Brevibacterium flavum törzzsel tenyésztést végzünk, így 3,4 g/1 L-prolin kitermelést kapunk. 2. Példa A fermentálási körülmények és a fermentáláshoz alkalmazott táptalaj összetétele megegyezik az 1. példánál említettekkel azzal a különbséggel, hogy a táptalaj elkészítésénél még a komponensekhez 0,10 g/1 koncentrációban L-izoleucint adunk és a különböző lombikokban levő táptalajt AP 111, AP 112 és AP 113 Brevibacterium flavum törzzsel fertőzzük. A fermentálás során keletkező kultúrafolyadékban az L-prolin koncentrációit a következő 2. táblázatban közöljük. 2. táblázat Brevibacterium L-Prolin flavum törzs (g/0 AP 111 56,6 AP 112 76,5 AP 113 97,5 Azonos körülmények között végzett fermentálásnál az ATCC 14067 deponálási számú Brevibacterium flavum törzs izoleucin-auxotróf mutánsainál az L-prolin kitermelés alig éri el a 20 g/l-t. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás L-prolin előállítására Brevibacterium flavum törzsbe tartozó mikroorganizmusok mutánsainak asszimilálható szén és nitrogénforrást, szervetlen és szerves sókat, valamint növekedést fokozó hatású anyagokat tartalmazó táptalajon végzett fermentálásával, azzal jellemezve, hogy prolin-analógokkal és magas ozmózisnyomással szemben rezisztens valamint L-prolin lebontásra képtelen mutánsokat alkalmazunk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
