199898. lajstromszámú szabadalom • Fermentációs eljárás L-prolin előállítására
1 HU 199898 B 2 A találmány tárgya eljárás L-prolin előállítására mikroorganizmusok mutánsainak fermentálásával. Az egyik legfontosabb és a gyógyászatban is alkalmazott aminosav az L-prolin. A találmány célja az L-prolin kitermelésének növelése. Ezt úgy oldottuk meg, hogy Brevibacterium flavum mutánsait alkalmaztuk, amelyek ti? egyidejűleg rezisztensek a 3,4-dehidro-DL-prolinnal (későbbiekben DP-nek nevezzük), valamint a tápközeg magas ozmózisnyomásával szemben, és amelyek nem képesek az L-prolint lebontani. Az L-prolin kitermelését fokozzák a baktériumoknak azon mutánsai, amelyek a DP- vel és a táptalaj magas ozmózisnyomásával szemben rezisztensek és az L-prolin lebontására képtelenek, valamint ezeknek a mutánsoknak a kombinációi is. Ezenkívül a kitermelést növelhetjük egyéb mutánsokkal is, így például az L- izoleucin auxotrófia során keletkező mutánsokkal. Az L-prolint termelő törzsekre példaként megnevezzük a Brevibacterium flavum következő mutánsait, amelyeket a találmány szerinti eljárásban alkalmaztunk és amelyek a megfelelő CMPM-B deponálási számon vannak nyilvántartva a VNII-genetikai intézet ipari mikroorganizmusok központi gyűjteményében: AP 111 (CMPM B-3258), AP 110 (CMPM B-3317), AP 112 (CMPM B-3259) és AP 113 (CMPM B- 3260) Brevibacterium törzsek. Ezeket a törzseket az ATCC 14067 deponálási számú Brevibacterium flavum törzsből genetikai szelektálással nyertük. Az Ap 111 és az AP 112 törzsek olyan mutánsok, amelyek egyidejűleg rezisztensek a DP-vel és a tápközeg magas ozmózisnyomásával szemben. Az AP 110 és az AP 113 olyan mutánsok, amelyek egyidejűleg rezisztensek a DP-vel és a tápközeg magas ozmózisnyomásával szemben, és amelyek képtelenek az L-prolin lebontására. Az AP 111, az AP 112 és az AP 113 törzsek a felsorolt jellemzők és a prolintermelő tulajdonság kivételével kultúra morfológiai, kultúra és fiziológiai jellemzők tekintetében azonosak az ATCC 14067 deponálási számú Brevibacterium flavum törzzsel. A DP-vel és a lápközeg magas ozmózisnyomásával szemben rezisztens, valamint L-prolin lebontására képtelen és az L-izoleucin auxotrófia során keletkező mutánsokat a baktériumok mutációjával lépcsőzetesen és tetszés szerinti sorrendben tetszés szerinti hagyományos eljárással (például N-metil-N-nitro-N-nitrozoguanidinnel végzett kezeléssel, illetve UV besugárzással) előállíthatjuk. Ezt követően meghatározzuk a megfelelő mutánsokat. Az említett mutánsokat különböző törzsekkel is előállíthatjuk és valamilyen géntechnológiai módszerrel, például protoplaszt fúzióval egy genommá egyesítjük. A tápközegek ozmózisnyomását növelő vegyületekként alkalmazhatunk szacharózt, illetve alkálifém-kloridot, például nátrium-kloridot. A következőkben konkrét munkafolyamatokat írunk le a találmány szerinti eljárásban alkalmazott L-prolint termelő törzsek előállítására. Brevibacterium fluvium AP 110 törzs előállítása Az ATCC 14067. számú Brevibacterium flavum törzset hús-pepton tápoldatban (továbbiak- 5 ban HPB) 30 “C hőmérsékleten levegőztetés közben 10® sejt/ml kultúrafolyadék titer eléréséig tenyésztjük. A sejteket az FPB-től centrifugálissal elválasztjuk, 5,6 pH-jú citrát-pufferrel mossuk, ismét centrifugáljuk és pH - 5,5 citrát- 10 pufferrel reszuszpendáljuk. A keletkezett szuszpenzióhoz N-metil-N’-nitrozoguanidint adunk (a későbbiekben NG), így 300 /ig/ml végkoncentrációt érünk el. A szuszpenziót 20 percig 30 #C hőmérsékleten levegőztetés közben inkubáljuk. 15 Ezután a sejteket a kihűlt FPB-től mosással elválasztjuk, 10 ml FPB-vel kémcsövekbe töltjük, és 18 óra alatt 30 °C hőmérsékleten levegőztetés közben inkubáljuk. 20 A keletkezett mutagénezett NG-kultúrát centrifugálással leülepítjük, és az 1. sz. táptalajt tartalmazó kémcsövekbe töltjük. A táptalaj öszszetétele: 25 szacharóz Na2S04 kh7po4 MgS04.7H20 30 NH4CI nh4no3 MnS04.5H?0 FeS04.7H20 biotin 35 tiamin-klorid és DP 1,5 pH = 7,4 40 Minden egyes kémcsőben a kultúra kezdeti litere 10s sejt/ml. A kultúrát levegőztetés közben 30 °C hőmérsékleten zavarosodásig (48 — 72 óra) tenyésztjük, majd 2% agar-agart tartalmazó 1. 45 sz. táptalaj felületére helyezzük, és 48 óra alatt 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk. Ezen a táptalajon tenyésztett egyik mutánst ismét NG-mutációnak alávetjük (a fent leírt módon) és a 2. sz. agarizált táptalajra helyezzük. A 2. sz. táptalaj ösz- 50 szetétele 1 ml-re vonatkoztatva mg glükóz 20,0 Na2S04 2,0 55 K2HP04 3,0 KH2P04 1,0 NH4C1 3,0 nh4no3 1,0 MgS04.7H20 0,1 60 MnS04.5H20 Í.IO"4 FeS04.7H20 1.10^ biotin 5.10"5 tiamin-klorid 1.10*4 agar-agar 20,0 65 pH - 7,4 mg 250,0 2,0 1,0 0,1 5,0 í.io-4 1.10^* 2.10'5 1.10.4 2
