199897. lajstromszámú szabadalom • Eljárás tisztított dezacetoxi-cefalosporin C-szintetáz enzim előállítására
1 HU 199897 B 2 mázzá, HPLC-vel analizáljuk az alábbiakban ismertetett módon. Az expandázaktivitás megállapításánál a dezacetoxi-cefalosporin-C-t és a dezacetil-cefalosporin-C-t egyaránt mérjük az enzim bifunkcionális jellegéből következőleg. A hidroxilázaktivitás vizsgálatánál a dezacetoxi-cefalosporiin-C-ből keletkező dezacetil-cefalosporin-C-t határozzuk meg. 20 — 100 >il felülúszót használunk a dezacetoxi-cefalosporin-C és a dezacetil-cefalosporin-C HPLC-vel történő meghatározásához, külső standardot alkalmazva. Előnyös HPLC rendszer: Model 721 rendszer irányító egység, Model 730 adatfedolgozó, Model 710B Waters Intelligent Sample Processor, Model 510EF pumpák és egy Lambda-Max Model 481 LC spektrométer (Waters Assoc., Milford, MA, USA). A dezacetil-cefalosporin-C-t és a dezacetoxicefalosporin-C-l előnyösen /iBondapak-NH4 oszlopon (0,8 x 10 cm) (Waters Assoc.) választjuk el. Mozgófázis: 2% ecetsav/0 — 4% metil-alkohol/6 —7% acetonitril/87 — 92% viz; pH = 3,8; áramlási sebesség: 1,5-2,0 ml/perc; detektálás 260 nm-en (cefalosporin kromofor). A meghatározások mind az expandáz, mind a hidroxiláz meghatározásánál 2%-os szórással reprodukálhatók. A 3. ábra a két aktivitás tipikus HPLC kromatogramját mutatja. Az expandáz vizsgálatnál a DAC mennyiségéi — a koelució miatt — a penicillin-N mennyiségével korrigáljuk. Molekulatömeg meghatározása - A gyenge anioncserélő gyantáról származó (2. lépés) aktív expandáz molekulatömegét Bio-Gel A 0,5m oszlopon (1,6x100 cm) történő gélszűréssel határozzuk meg. Az oszlopot előzőleg ekvilibráljuk 50 mM Tris-HCl pufferrel, pH= 7,5, ami 1 mM koncentrációban ditiotreitolt és 1 mM koncentrációban aszkorbátot is tartalmaz. A rendszer kalibrálásához élesztő alkoholdehidrogenázt (MS: 80000), borjú szérum-albumint (BSA, MS: 66200), ovalbumint (MS: 450000) karbonát-dehidratáz (MS: 31000) és ribonukleázt (MS: 13700) használunk. A FPLC-vel tovább tisztított enzim minimális molekulatömegét a nátrium-dodecil-szulfátos poliakrilamid gélelektroforézissel határozzuk meg protein molekulatömeg standardokat alkalmazva. Izoelektromos fókuszálás — A tisztított enzim izoeleklronn.., pontját Anderson, N. G. és Anderson N. L. módszerével határoztuk meg (Anal. Biochem., 85: 331 - 340 (1978)]. Az elektroforézist 5% amfolittel (pH = 3—10; Pharmacia., Inc.) végezzük akrilamidgélben. A proteineket ezüstsóval tesszük láthatóvá. Aminosavösszetétel — A tisztított enzimet Mono Q erős anioncserélő gyantán tovább tisztítjuk FPLC-vel, és az eluálum fehérjét használjuk fel az aminosavösszetétel meghatározására. Az eluátumot 6 n sósavban hidrolizáljuk, 110 °C hőmérsékleten 24, 48, 72 és 96 órán át. Az aminosavakat integrátorral ellátott Beckman Model 6300 aminosavanalizátorral határozzuk meg. A treonin és a szerint mennyiségét a hidrolízis 0 idejére extrapoláljuk. A ciszteint, mint ciszteinsavat határozzuk meg a dimetil-szulfoxidos oxidáció után. A triptofánt tioglikolsavas hidrolízissel határozzuk meg. Proteintartalom — az enzimpreparátum proteintartalmát Bradford, M.M. [Anal. Biochem., 72: 248 — 254 (1976)] módszerével határozzuk meg standardként borjú szérumalbumint használva. Az elmondottak szemléltetésére az alábbiakban egy példát adunk meg. Példa Nagy cefalosporin-C termelőképességű Cephalosporium acremonium ATCC 36225 törzset 96 órán át tenyésztünk 50 milliliteres Erlenmeyer lombikokban Queener, S.W. és munkatársai által leírt összetett folyékony táptalajon ("Cephalosporin C fermentation: Biochemical and regulatory aspects of sulfur metabolism", 141 — 170. old., in: E. J. Van Damme (szerk): "Biotechnology of industrial antibiotics", Marcel Dekker, Inc,, New York). A sejteket 20000 g-én 10 percen át centrifugálva összegyűjtjük, 50 mM Tris-HCl pufferrel, pH = 7,5, 1,0 mM kálium-kloridot nem tartalmazó pufferral mossuk. A dezacetoxi-cefalosporin C-szintetáz tisztítását 0 - 4 °C hőmérsékleten végezzük. 600 g nedves tömegű friss sejtet 50 mM Tris- HCl pufferben, pH = 7,5, szuszpendálunk. A puffer a további alkotórészeket is tartalmazza: 10% glicerin, 10% etil-alkohol, 10 mM ditiotreit, 10 mM aszkorbát. A szuszpenzió össztérfogata 1 liter. A szuszpendált sejteket ultrahanggal 4 °C vagy az alatti hőmérsékleten feltárjuk. A feltárás alatt több adagban fenil-metil-szulfonil-fluoridot adunk a szuszpenzióhoz, míg a végtérfogat 2 mM nem lesz. 1 ng/ml koncentrációban dezoxi-ribonukleázt, 2 mM koncentrációban magnézium-szulfátot adunk a preparátumhoz. A feltárt szuszpenziót 40000 g-én 30 percen át centrifugáljuk, és a felülúszót elválasztva nyerjük a nyers enzimkivonatot. A nyers enzimkivonat összesen 12500 mg proteint tartalmaz, fajlagos aktivitása 0,039 egység/mg, összaktivitá&a 485 egység. A nyers extraktumot DEAE-trisakril LS oszlopra (5x300 cm) visszük, melyet előzőleg GEDA pufferrel ekvilibráltunk. Az enzim nem marad az oszlopon, ha 50 mM Tris-HCl pufferrel eluálunk, de a visszamaradó proteinek következtében a szűrletben kb. 1,6-szorosára tisztul. Az eluátumban az összprotein 6200 mg, fajlagos aktivitás 0,063 egység/mg, összaktivitás 393 egység. Az ' eluátumot DEAE-cellulóz oszlopra (2,5x41 cm) visszük, amit előzőleg GEDA pufferrel ekvilibráltunk. Az oszlopot 4-oszloptérfogatnyi mennyiségű GEDA pufferrel mossuk 0,05 M kálium-klorid jelenlétében. Mosás után a GEDA pufferben 0,05 M-tól 0,60 M-ig káliumklorid lineáris grádienst kialakítva, eluáljuk az 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
