199897. lajstromszámú szabadalom • Eljárás tisztított dezacetoxi-cefalosporin C-szintetáz enzim előállítására
2 HU 199897 B 1 oszlopot. A lineáris grádienst 800 ml pufferben alakítjuk ki. 25 ml/óra átfolyási sebesség mellett 10 milliliteres frakciókat gyűjtünk. 0,04 M és 0,06 M kálium-klorid koncentrációk között eluálódik az enzim egy föcsúcsban és két mellék- 5 csúcsban. Az összaktivitásnak kb. 75%-a van a főcsúcsban. A főcsúcs frakcióit, melyekben a fajlagos aktivitás 0,088 egység/mg-nál magasabb, egyesítjük és Amico ultrafiltrációval PM30 membránon 9,5 ml térfogatra töményítjük. A be- 10 töményített oldatot Sephocryl S-200 oszlopra (5x85 cm) visszük, amit előzőleg GEDA pufferten ekvilibráltunk. 40 ml/óra átfolyási sebesség melleit 10 milliliteres frakciókat gyűjtünk. A legalább 0,33 egység/mg fajlagos aktivitású frakció- 15 kát egyesítjük és hidroxilapatit oszlopra (1,6x95 cm) visszük, amit előzőleg GEDA pufferrel ekvilibráltunk 20 mM kálium-foszfát jelenlétében. Az oszlopot 2 oszloptérfogatnyi ugyanilyen pufferrel mossuk. Az enzimet lépcsőzetes grádiens- 20 elucióval eluáljuk 100 ml GEDA pufferrel, melyben a kálium-foszfát koncentráció 30, 40, 60, 80, illetve 100 mM. 5 milliliteres frakciókat gyűjtünk 15 ml/óra átfolyási sebesség mellett. Az enzim egy fő és egy mellékcsúcsban jelenik meg. A fő- 25 csúcs az összaktivitásnak kb. 80%-át tartalmazza. Az enzimet tartalmazó egyes frakciókhoz fenil-metil-szulfonil-fluoridot adunk 0,25 mM koncentrációban. A fúőcsúcs azon frakcióját, melyben a fajlagos aktivitás 0,827 egység/mg 30 Mono O oszlopon gyors protein folyadékkromatográfiával tovább tisztítjuk (FPLC; Pharmacia Inc., Piscataway, NJ. USA). A főcsúcs legmagasabb fajlagos aktivitású frakciójának egy részét (5,6 mg protein) Mono 35 Q oszlopra (0,5x5 cm) visszük, amit előzőleg GEDA pufferrel ekvilibráltunk. Az enzimet lineáris gradiens elucióval eluáljuk, 32 ml GEDA pufferben a kálium-klorid koncentrációt 0-ról 0,4 M-ra emelve. 30 ml/órás átfolyási sebességnél 40 1 milliliteres frakciókat gyűjtünk. A Mono Q FPLC aktivitását és a protein-kromatogramját az 1D ábrán mutatjuk be. Az enzim jellemző adatai megegyeznek a leílró részben megadottakkal, tisztasága és fajlagos aktivitása pedig a II. 45 táblázatban leírtakkal. A hidroxiapatit azon további frakcióit, melyeknek a fajlagos aktivitása nagyobb, mint 0,558 egység/mg, egyesítjük és DEAE-Sepharóz oszlopra (1,6x95 cm) visszük, amit előzőleg GEDA 50 pufferben ekvilibráltunk. Az oszlopot 2-oszloptérfogatnyi pufferrel mossuk 0,05 M kálium-klorid jelenlétében. Az enzimet 400 ml GEDA pufferten kialakított lineáris kálium-klorid grádicnssel eluáljuk, a sókoncentrációt 0,05 M-ról 0,6 55 M-ra emelve. 15 ml/óra átfolyási sebesség mellett 5 miiliteres frakciókat gyűjtünk. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 60 1. Eljárás tisztított — expandáz és hidroxiliz aktivitással rendelkező — dezacetoxi-ceíalosporin-C-szintetáz enzim előállítására, mely egy monomer protein, melynek gélszűréssel megállapl- 65 tolt molekulatömege 43000, nátrium-dodecil-szulfát/poliakril-amid gélektroforézissel (SDS-PAGE) megállapított minimális molekulatömege 41000, izoelektromos pontja 6,0 ± 0,5, és aminosavösszetétele a következő: Aminosav 41000 Daltonra eső savmaradék száma Asx (Asp + Asn) 37 Thr 24 Ser 26 Glx(Glu-i-Gln) 35 Pro 21 Gly 31 Alá 34 Val 32 Cys 6 Met 5 Ile 8 Leu 27 Tyr 10 Phe 20 His 6 Lys 17 Arg 29 TrP 3 Összesen 371 azzal jellemezve, hogy i) proteázgátlót, pH = 7,8 kémhatású puffert és GEDA-t tartalmazó sejtmentes, nyers vizes enzimkivonatot gyenge anioncserélő gyantára visszük, az enzimet GEDA-t tartalmazó káliumklorid vagy nátrium-klorid, vagy Tris-HCl grádienssel eluáljuk, majd ii) az i) lépésből származó, az enzimet tartalmazó eluátumot keresztkötéses poliszaccharidgélen szűrjük, a gélt GEDA-val mossuk, és iii) az ii) lépésből származó, az enzimet tartalmazó szűrletet hidroxilapatitra visszük és az enzimet GEDA-t tartalmazó kálium-foszfát grádienssel eluáljuk, majd a kapott eluátumot kívánt esetben tovább tisztítjuk, ahol a GEDA jelentése: 5-15% glicerin vagy szaccharóz, 5-15% 1-3 szénatomszámú egyértékű alkohol, 1-20 mM koncentrációban szulfhidrilcsoportot tartalmazó redukálószer és 1 — 20 mM koncentrációban aszkorbát. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont iii) lépéséből származó, az enzimet tartalmazó eluátumot erős anioncserélő gyantára visszük, és az enzimet GEDA-t tartalmazó kálium-klorid, vagy nátrium-klorid vagy Tris-HCl grádienssel eluáljuk. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az i) lépés anioncserélő gyantáját, az ii) lépés géljét és az iii) lépés hidroxiapatitját GEDA-val ekvilibráljuk, mielőtt az enzimet rávinnénk. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nyers enzimkivonatot Tris-HCl pufferral, pH » 7,5, pufferoljuk. 5. Az 1. vagy 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan GEDA-t alkalmazunk, melyben a glicerin vagy a cukor kocentrációja 10%, az 1 — 3 szénatomszámú egyértékű alkohol 8
