199897. lajstromszámú szabadalom • Eljárás tisztított dezacetoxi-cefalosporin C-szintetáz enzim előállítására
1 HU 199897 B 2 A tisztított enzim bifunkcionaiitása következtében a penicillin-N-et dezacetoxi-cefalosporin- C-vé és dezacetil-cefalosporin-C-vé alakítja át 60 perces reakció alatt. A DAOC + DAC/penicillin-N sztöchiometrikus aránya 1:1. Hasonlóképpen, a tisztított enzim 60 perces reakció alatt kvantitatíve átalakította a dezacetoxi-cefalosporin-C-t dezacetil-cefalosporin-C-vé, megerősítve az 1:1 sztöchiometrikus arányt. A dezacetoxi-cefalosporin-C szintetáz instabilitása miatt, ezt megelőzően nem kapták meg az enzimet tisztított állapotban. Mint már fentebb említettük, a találmány eljárást nyújt az enzim tisztítására, melynek lényege, hogy a kromatográfiás lépéseket GEDA jelenlétében végezzük és ezzel stabilizáljuk az enzimet a tisztítási folyamat alatt. A GEDA jelenlétében tisztított enzim a harmadik lépés után, további tisztítás nélkül 4 °C hőmérsékleten 4 napig tartva aktivitásának 96%át, 7 napig tartva, aktivitásának 87%-át őrzi meg. A találmány szerint tisztított enzimet későbbi felhasználáshoz GEDA pufferben tároljuk -70 4C hőmérsékleten. A találmány lehetőséget nyújt a dezacetoxi-cefalosporin C-szintetáz enzim stabilizálására is. Ez abból áll, hogy a pH= 7 — 8 kémhatású enzimoldatot vagy szuszpenziót glicerint vagy szaccharózt, 1-3 szénatomszámú egyérlékű alkoholt, szulfhidrilcsoporttal rendelkező redukálószert és aszkorbátot tartalmazó eleggyel keverjük össze. A közegben a koncentrációk a következők: szaccharóz 5 — 15% (tömeg); glicerin és az 1 — 3 szénatomszámú alkohol mindegyike 5 — 15% (térfogat); a szulfhidrilcsoportot tartalmazó redukálószer és az aszkorbát végkoncentrációja egyaránt 1 mM —20 mM. Az enzimpreparátumot az ismertetett elegyben - 70 °C és 5 °C közötti hőmérsékleten tartjuk. Az enzim vizes oldata vagy szuszpenziója lehet a nyers sejtkivonat, egy részlegesen tisztított vagy a találmány eljárása szerint tisztított enzimpreparátum. Az enzim nyers sejtkivonatát előnyös szerinproteáz-inhibitorral, például fenilmetil-szulfonil-fluoriddal vagy diizopropil-fluor-foszfáttal is kezelni. Az aszkorbáton az aszkorbinsav egy sóját, például a nátrium- vagy káliumsóját értjük. Előnyösebb a szaccharóz helyett glicerint használni és az etil-alkohol előnyösebb a inetilalkoholnál. Mindkettőt előnyös 10%-ban (térf.) alkalmazni. A ditiotreit előnyös szulfhidriltartalmú redukálószer. A ditiotreitet és az aszkorbátot előnyösen 10 mM koncentrációban alkalmazzuk a stabilizáló elegyben. A stabilizált enzimpreparátum előnyös kémhatása pH = 7 és 8 között van, legelőnyösebb pH s 7,s értéknél. A kívánt kémhatást alkalmas pufferrel, például Tris-HCl pufferrel tartjuk fenn. Az enzimstabilizáló módszer hatékonyságát a nyers sejtkivonaton szemléltetjük. Egy tipikus sejtkivonatban az enzim 50 mmóios Tris-HCl pufferben van, melynek kémhatása pH » 7,5, a sejtkivonat' a fenil-metil-szulfonil-fluoridot 2 mM, az etil-alkoholt 10%, a glicerint 10%, a ditiotreitet 1 mM és az aszkorbátot 1 mM koncentrációban tartalmazza. Ebben a közegben, 4 °C hőmérsékleten tartva, az enzimaktivitás 7 nap elteltével 100%-ban megmaradt. Az előállított stabilizált enzimkészítmény az alábbi összetételű: pH = 7-8 kémhatású vizes enzimoldat, 5 — 15% végkoncentrációban glicerin vagy szaccharóz, 5-15% végkoncentrációban 1-3 szénatomszámú, egyértékű alkohol, 1-20 mM végkocentrációban szulfhidriltartalmú redukálószer és aszkorbát. Az előnyösen elkészített készítmény mind a ditiotreitet, mind az aszkorbátot 10 mM koncentrációban tartalmazza. A készítményt hidegen, előnyösen 0 - 5 °C hőmérsékleten készítjük el. Az alkotórészeket bármilyen sorrendben, egyenként adjuk az enzimoldathoz. Eljárhatunk úgy is, hogy a stabilizáló anyagokból először egy elegyet készítünk és ezt adjuk kívánt koncentrációban az enzimoldathoz. A glicerin előnyösebb a szaccharóznál, az alkoholok közt legelőnyösebb az etil-alkohol. A találmány eljárása szerint nyert tisztított enzim alkalmas a dezacetoxi-cefalosporin-C előállítására, ami a cefalosporin-vázú 7-amino-dezacetoxi-cefalosporin-C (7-ADCA) előanyaga. A 7-ADCA-t ismert eljárásokkal acilezve 3-metilcefalosporin antibiotikumokat, például cefalexint nyerünk. A dezacetil-cefalosporin-C felhasználható a 3-aciloxi-cefalosporin antibiotikumok előállítására. A tisztított enzim felhasználható az enzim aminosavsorrendjének meghatározásához, aminek ismerete klónozási kísérletekben fontos. Felhasználhatjuk a tisztított enzimet a penicillinek antibiotikus aktivitással rendelkező cefalosporinokká való átalakítására is. Az alábbiakban ismertetetjük az eljárásunk során alkalmazott meghatározási módszereket: Enzimaktivitási vizsgálat — Az enzim tisztaságának megállapítására, a tisztítási folyamat nyomonkövetésére a kromatográfiás frakciók expandáz és hidroxiláz aktivitását HPLC analízissel határozzuk meg, illetve a kromatográfiás frakciók protein összetételét nátrium-dodecilszulfátos poliakril-amid elektroforézissel (SDS-PAGE) analizáljuk. Az expandázaktivitás meghatározásához a reakcióelegyet 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk 15 percen keresztül. Az 1 ml 50 mM Tris-HCl pufferben, pH= 7,5, 0,0003 - 0,003 egység enzimet tartalmazó oldatban az alkotórészek koncentrációja a következő 0,28 mM peniciiiin-N-szubsztrát, 0,60 mM a-ketoglutarát, 0,06 mM vas(ll)-szulfát, 0,67 mM aszkorbát, 1,00 mM ditiotreit és 0,05 mM ATP. A hidroxilázaktivitás meghatározásához az enzim-katalizálta reakciót 36 °C hőmérsékleten végezzük a fent ismertetett reakcióelegyben, azzal a különbséggel, hogy szubsztrátként a penicillin- N helyett dezacetoxi-cefalosporin-C-t használunk, 0,05 mmóios koncentrációban. Az enmzimreakciót 1 ml etil-alkohol hozzáadásával leállítjuk. A csapadékot 4000 g-n 5 percig történő centrifugálással elválasztjuk, és a feiülúszót, ami az enzimreakció termékét tartal-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
