199897. lajstromszámú szabadalom • Eljárás tisztított dezacetoxi-cefalosporin C-szintetáz enzim előállítására
1 HU 199897 B 2 Folytatva a 3. lé pèses folyamatot, a tisztítás kívánt esetben alkalmazott 4. lépését végezhetjük keresztkötéses poliszaccharid-típusú gyantán - például keresztkötéses agarózon, mint amilyen a DEAE Sepharose (Pharmacia, Inc.,) — végzett kromatografálással. Előnyösen a 3. lépés nagy aktivitású frakcióit egyesítjük, és ezt visszük a gyantára. A gyantát GEDA pufferrel ekvilibráljuk és az enzimet lineáris grádiens elucióval eluáljuk GEDA pufferben a kálium-klorid vagy a nátrium-klorid koncentrációját 0,05 M-ról 0,6 M-ra emelve. A találmány szerinti eljárással 0,2-0,8 egység/mg fajlagos aktivitású tisztított dezacetoxicefaiosporin C-szintetázt nyerünk. A folyamat egy példájában 600 g friss sejtből a fentiek szerint nyert nyers enzimkivonatot 2,5x41 cm-es DEAE cellulóz oszlopon kroraatografáijuk, amit előzőleg a GEDA pufferrel ekvilibrálunk. A gyantát először 0.05M kálium-kloridot tartalmaz GEDA pufferral mossuk. Az enzimet GEDA pufferben kialakított kálium-kloridos lineáris gradienssel eluáljuk, a kálium-klorid koncentrációját 0,04 M-ról 0,6 M-ra növelve, 10 milliliteres frakciókat gyűjtünk. Az áramlási sebesség 25 ml óránként. A frakciókat HPLC-vel analizáljuk az alábbiakban ismertetendő módon. Az enzim 0,04 és 0,06 M káliumklorid koncentráció között jön le egy főcsúcsban és két mellékcsúcsban. Az enzim összaktivitásának kb. 85%-a van a főcsúcsban. A főcsúcs azon frakcióit, melyekben a fajlagos aktivitás nagyobb, mint 0,088 egység/tng, egyesítjük és ultraszűréssel betöményítjük. A koncentrátumot előzőleg GEDA pufferrel ekvilibrált Sephacryl S-200 gyantán (Pharmacia, Inc., Piscataway, NJ, USA) kromatografáljuk. Az aktivitást GEDA pufferral eluáljuk az oszlopról, 10 milliliteres frakciókat gyűjtve 40 ml/óra áramlási 5 sebesség mellett. A legalább 0,33 egység/mg fajlagos aktivitású frakciókat egyesítjük. Az egyesített frakciókat előzőleg 20 mM káliumfoszfátos GEDA pufferben ekvilibrált hidroxiapatiton kromatografáljuk. Az expandázt lép- 10 esős grádiens elucióval kromatografáljuk, eluensként 30, 40, 60, 80 és 100 mM kálium-foszfátos GEDA puffert használva. 15 ml/óra áramlási sebesség mellett 5 milliliteres frakciókat gyűjtünk. A dezacetoxi-cefalosporin C-szintetáz egy 15 főcsúcsban és néhány mellékcsúcsban jön le az oszlopról. A főcsúcs — mely az összaktivitás 80%-át tartalmazza — frakcióiban a fajlagos aktivitás 0,558 egység/mg értéknél magasabb. A frakciókat proteázgátlóval, például fenil- 20 -metil-szulfonil-fluoriddal kezeljük. A gátlószer 0,25 mM koncentrációjú. A nyers enzimpreparátumot különféle, cefalosporin-C-t termelő mikroorganizmusból nyerhetjük. Előnyösen a sejtkivonat elkészítéséhez 25 olyan mikroorganizmusokat használunk, ami magas cefalosporin-C termelőképességgel rendelkezik. Alkalmas enzimforrás lehet a Cephalosporium acremonium (chrysogenum) ATCC 11550, C. acremonium (chrysogenum) 30 ATCC 36225 és a C. acremonium (chrysogenum) ATCC 48277 törzsek. Ugyancsak alkalmas enzimforrás az ismert cefalosporin-C termelő Streptomyces clavuligerus. A tisztított enzim (3. lépés) expandáz, illetve 35 hidroxiláz tevékenységének optimális körülményeit foglaljuk össze a III. táblázatban. III. táblázat Az enzimtevékenység optimális körülményei Reakciókörülmények expandáz aktivitás hidroxiláz pH optimum 7,5-7,8 7,3 nőmérsékletoplimum (°C) JFe2 + J minimális telített-26-34 36-38 ség(/iM) maximális reaktiváció/ /stimuláció* 50 50 ditiotreitel (1,0 mM) 0-ról 50-re 0-ról 0,23-ra aszkorbáttal (0,25 mM) 0-ról 90-re 0-ról 0,81-re ATB-vel (0,05 mM) 38-ról 52-re 0,57-ról 0,61-re •megadva a kezdeti és végső aktivitás; egység x 10'3 5
