199897. lajstromszámú szabadalom • Eljárás tisztított dezacetoxi-cefalosporin C-szintetáz enzim előállítására
1 HU 199897 B 2 Az aktivitással rendelkező, a főcsúcsot kitevő frakciókat egyesítjük, és a folyamat második lépéseként gélszűrésnek vetjük alá. Hogy ne kelljen nagy mennyiségű gélt használjunk, az egyesített frakció térfogatát előnyös csökkenteni, például ultraszűréssel, hogy kb. SO mg/ml koncentrációjú proteinoldathoz jussunk. A gélt előzőleg GEDA pufferben ekvilibráljuk, mielőtt az első lépésből származó egyesített frakciókat, vagy a betöményített proteinoldatot rávinnénk. A gélről az enzimet GEDA pufferrel mossuk le, és a frakciókat HPLC-vel analizáljuk. Az 1B ábrán mutatjuk be a 2. lépés, a gélszűrés eredményeit. A 2. lépéshez számos, a kereskedelemből beszerezhető keresztkötéses poliszaccharid-gélt alkalmazhatunk. így például használhatunk keresztkötéses dextránsokat, mint amilyen a Sephadex, keresztkötéses agarózt, mint amilyen a Sepharose és kovalens kötött akrildextránokat, mint amilyen a Sephacryl. Ezek a gyanták a Pharmacia, Inc., cégtől beszerezhetők. A gélszűrés azon frakcióit, amelyeknek a fajlagos aktivitása legalább 0,3 egység/mg, egyesítjük, és a hidráit kálcium-foszfátra, például hidroxiapatitra visszük. Ez a folyamat 3. lépése. A hidroxiapatilot felhasználás előtt 20 mM káliumfoszfátos GEDA pufferben ekvilibráljuk. Az enzimet vagy lépcsőzetes gradienselucióval — 30, 40, 60, 80 és 100 mM kálium-foszfát eluenssel — vagy lineáris grádienselucióval - a kálium-fosz- S fát koncentrációját 20 mM-ról folyamatosan 100 mM-ra változtatva - oldjuk le. Az enzim egy főcsúcsban és néhány kis csúcsban jön létre. A főcsúcsot alkotó frakciókban a fajlagos aktivitás nagyobb, mint 0,500 egység/mg. A frakciókat 10 egyesítjük vagy külön-küiön használjuk. Adott esetben a frakciószedés vagy egyesítés után az enzimoldatot szerin-proteáz-gátlóval, például fenil-metil-szulfonil-fluoriddal (PMSF) kezeljük. A PMSF gátlószert általában 0,25 mM kon- 15 centrációban alkalmazzuk. A nyers enzimkivonat elkészítését és a kromatográfiás folyamatokat tanácsos 0-10 °C közötti, előnyösen 4 °C hőmérsékleten végezni. A háromlépéses tisztítási folyamatban nyert 20 enzim tisztasága megfelelő a penicillin-N dezacetoxi-cefalosporin-C-vé és dezacetil-cefalosporin-C-vé való hatékony átalakítására. Az IC ábra mutatja a háromlépéses tisztítási eljárás eredményeit. A 3. lépés után az enzim ál- 25 tálában 80 — 85%-os tisztaságú. A II. táblázat mutatja az enzim tisztulását a nyers extraktumból kiindulva. II. táblázat A folyamat lépése Össz- Összaktivitás Fajlagos Tisztulási protein (egys.) (% kinyert) aktivitás arány (mg) (egys/mg) nyers sejtkivonat gyenge anioncserélő 12500 485 100 0,039 1,0 króm. (1. lépés) 900 138 29 0,154 3,9 gélszűrés (2. lépés) hidroxiapatit 260 119 25 0,453 11,7 (3. lépés) 90 57 12 0,633 16,2 Kívánt esetben az enzimet tovább tisztítjuk erős anioncserélő gyantán 95%-os tisztaságig. A 45 hidroxiapatitos kromatografálás főcsúcsának legmagasabb fajlagos aktivitású frakcióit (általában 0,8 egys/mg vagy magasabb) gyors protein folyadékkromatográfíával (FPI.C) kromatografáljuk erős anioncserélő gyantán. Előnyös gyanta 50 a Mono Q (Pharmacia, Inc.,) polimer anioncserélő gyanta. A gyantát előzetesen GEDA pufferben ekvilibráljuk, majd rávisszük a 3. lépés enzimet tartalmazó frakcióját. Az enzimet 0-tól 0,4M koncentrációig növekvő kálium-kloriddal vagy 55 nátrium-kloriddal vagy Tris-HCl grádienssel eluáljuk. Az 1D ábra mutatja az FPLC aktivitási és proteineluciós kromatogramját. A tisztítási folyamat 1. lépését módosíthatjuk úgy, hogy a nyers sejtkivonatot előzetes tisztításnak vetjük alá gyenge anioncserélő gyantán. A szennyező proteineket például elválaszthatjuk úgy. hogy az enzimet GEDA-t tartalmazó 50 mMólos Tris-HCl pufferrel lemossuk a gyantáról. Ennél a koncentrációnál az enzim nem marad a gyantán, viszont a szennyező protein igen, és ezzel 1,6-szoros tisztítást érünk el. Az enzimet tartalmazó mosóeluenst a fent ismertetett 1. lépés szerint gyenge anioncserélő gyantára viszszűk. 60 4
