199897. lajstromszámú szabadalom • Eljárás tisztított dezacetoxi-cefalosporin C-szintetáz enzim előállítására
1 HU 199897 B 2 Az enzim mindkét funkcióját gátolja a cinkion és az 5,5’-ditio-bisz|2-nitro-benzoesav]. Mindkettőről ismert, hogy szulfhidrilcsoporthoz kötődik, ezek szerint az enzim aktfv állapotában egy vagy több szabad szulfhidrilcsoportot tartalmaz. A találmány szerint tisztított enzimnél meghatároztuk néhány peptidfragmens aminosavsorrendjét. Cianogén-bromidos és tripszines hasítást követő fordított fázisú kromatográfiával az alábbi összetételű, 13 aminosavból álló fragmenst nyertük: Ala-Val-Leu-Asn-Ser-Val-Gly-Ala-Pro-Leu-Ala-Gly-Gln. . Tripszines emésztést követő fordított fázisú HPLC-vel az alábbi sorrendű, 12, 8 és 7 aminosavból álló fragmenseket kapjuk: Gly-Phe-Glu-Asp-Val-Trp-Glu-Asp-Tyr-Phe-Asp-Arg; Val-Ala-Glu-Glu-Glu-Pro-Leu-Arg; Ala-Val-Thr-Leu-Ala-Asp-Arg. A találmány eljárást nyújt dezaceloxi-cefalosporin C-szintetáz nagyfokú tisztaságban történő kinyerésére is. Az eljárás kulcsfontosságú jellemzője, hogy a többlépéses kromatográfia alatt stabilitást biztosít az enzimnek. A stabilitást úgy érjük el, hogy a tisztítást az alábbi anyagok jelenlétében végezzük: redukálószerek, például /?-merkapto-etanol, ditiotreit (DDT) vagy ditioeritreit és nátrium- vagy kálium-aszkorbát, mindkettő 1 — 20 mM koncentrációban; 5 - 15% 1 — 3 szénatomszámú, egyértékű alkohol, például metil-alkohol vagy etil-alkohol; 5 — 15% glicerin vagy szaccharóz. A tisztítási folyamat során maximális enzimstabilitást nyújtó előnyös összetételű elegy a következő: 10% (térf.) etil-alkohol, 10% (térf.) glicerin, 10 mM ditiotreit és 10 mM nátrium-aszkorbát. A stabilizációs elegyet a továbbiakban GEDA-ként rövidítjük. A GEDA nyilvánvaló szerepe, hogy redukált állapotban tartja az enzimet, azaz szabad szulfhidrilcsoportokkal rendelkezik, valamint hidrofób környezetet teremt az enzim számára, ami úgy látszik kedvez a maximális aktivitásának. Az eljáráshoz előnyösen frissen elkészített GEDA elegyet használunk. Az alábbiakban ismertetett eljárásban a GEDA elegyet pufferben, például pH = 7,5 kémhatású foszfát vagy Tris-HCl pufferben használjuk. A továbbiakban használt "GEDA puffer" kifejezés alatt ilyen puffert értünk. A találmány szerinti tisztítási folyamatban az enzimet tartalmazó nyers sejtextraktumot GEDA jelenlétében pH= 7 — 8 kémhatású pufferben vesszük fel és proteáz inhibitorral kezeljük. A sejtextraktumot először gyenge anioncserélő gyantán kromatografáljuk, amit előzőleg GEDA pufferben ekvilibrállunk. A gyantáról az enzimet GEDA pufferben levő kálium-kloriddal, vagy nátrium-kloriddal vagy Tris-HCl-dal eluáljuk és a frakciók aktivitását HPLC-vel állapítjuk meg. Az aktivitási csúcsot tartalmazó frakciókat gélszűrésnek vetjük alá. Az így tovább tisztított enzimet hidroxiapatiton (hidráit kálcium-foszfát) kromatografáljuk GEDA-ban kialakított kálium-foszfát grádienssel. A háromlépéses folyamat után az enzim a dodecil-szulfát/poliakrilamid elektroforézis (SDS — PAGE) szerint 80 - 85% tisztaságú. Az enzimet az alábbiak szerint tisztíthatjuk tovább: az összegyűjtött eluátumot adott esetben szerin-proteáz-gátlóval kezeljük, majd gyors protein folyadékkromatográfiával (Fast Protein Liquid Chromatography, FPLC) kromatografáljuk erős anioncserélő gyantán, az elucióhoz ismét a GEDA-ban kialakított kálium-klorid vagy Tris-HCl grádienst használva. Az így nyert enzim 95% tisztaságú. Az enzim aktivitását, ami tisztaságának kifejezője, aktivitás-egységekben (U) adjuk meg. Egy egységnyi dezocetoxi-cefalosporin C-szintetáz aktivitásnak tekintjük azt az enzimmennyiséget, mely a penicillin-N-ből egy perc alatt 1 /«mól dezacetoxi-cefalosporin-C-t és dezacetil-cefalosporin-C-t készít. Egy egységnyi hidroxiláz aktivitásnak tekintjük azt az enzimmennyiséget, mely ahhoz szükséges, hogy a dezacetoxi-cefalosporin-C-ből egy perc alatt 1 janól dezacetil-cefalosporin-C-t készítsen. A találmány szerinti eljárást egy háromlépéses folyamatnak tekinthetjük. Az első lépésben a Cephalosporin acremonium friss sejtszuszpenziójából pH= 7 — 8 kémhatású pufferben, előnyösen pH = 7,5 kémhatású 50 mmólos Tris- HCl pufferben, GEDA jelenlétében ultrahangos feltárással elkészítjük az enzimet tartalmazó nyers sejtkivonatot. Az ultrahangos kezelés alatt szerin-proteáz-gátlót, például fenil-metil-szulfonil-fluor időt (PMSF) vagy diizopropil-fluor-foszfátot (DFP) adunk a rendszerhez, hogy a sejtből kiszabaduló enzimet megvédjük. Az ultrahangos feltárást követően a sejttörmeléket és más oldhatatlan részeket centrifugálással eltávolítjuk, és az így nyert felülúszót, ami az enzimet tartalmazza, nevezzük "nyers sejtkivonatnak". Gyenge anioncserélő gyantát ekvilibrálunk GEDA pufferrel és rávisszük a nyers sejtkivonatot. A gyantát GEDA pufferrel, például GEDA- t tartalmazó pH- 7,5 kémhatású 15 mmólos Tris-HCl vagy nátrium- vagy kálium-foszfát pufferrel mossuk át. A mosott gyantáról az enzimet grádiens elucióval oldjuk le. A GEDA pufferben kialakított lineáris gradienst 50 mM-tól 600 mM-ig növekvő kálium-klorid vagy 15 mM-től 500 mM-ig növekvő Tris-HCl koncentrációval hozzuk létre. A frakciókat az alábbiakban ismertetett módon HPLC-vel analizáljuk. A 40 mM és 60 mM kálium-klorid koncentráció vagy a 80 mM és 100 mM tris-HCl koncentráció között lejövő frakciók tartalmazzák az expandáz aktivitás egy fő és két kis csúcsát. Az 1A ábrán szemléltetjük a gyenge anioncserélőn végzett tisztítás eredményeit. Gyenge anioncserélő gyantaként használhatunk cellulóz-származékokat, mint például a kereskedelmi forgalomból beszerezhető dietil-amino-etil-cellulózt (DEAE-cellulóz, Whatman, Inc.) vagy akril kopoiimer gyantákat, például az N-[trisz(hidroxi-metil)metil]-akril-amid kopolimereket, mint amilyen a dietil-amino-etil-triszakril (DEAE-trisacryl LS, LKB Instruments Inc.), stb. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
