199882. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új, vazopresszin antagonista hatású, polipeptidek és ezeket hatóanyagként tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
HU 199882 B 2 DMF-ban oldunk és 36,2 pl (239 /«mól) trietilamint, majd 28,0 jtl (130 ftmól) difenil-foszforil azidot adunk hozzá. Az oldatot 3 napon át 4 °C- on tartjuk. A reakcióelegyet szárazra pároljuk, és a visszamaradó anyagot éterrel eldörzsöljük. A kapott nyers gyűrűs peptidet ezután HPLC eljárással, Hamilton PRP-l-en, 0,1% trifluor-ecetsavat tartalmazó 33%-os vizes acetonitril eluens alkalmazásával tisztítjuk, majd 1 mól/l-es ecetsavból liofilizáljuk. így 90 mg gyűrűs peptidet nyerünk. FAB-MS m/z 1102 (MH + ); HPLC k’ = 4,5 (IBM ODS, mobil fázis: A = 0,1 mól/1 trietil-ammónium-foszfát, B = acetonitril, lineáris gradiens 30 — 40% B, 10 perc; 40 — 60% B, 20 perc.) 6. példa D-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-D-Pas-Arg-D-Arg- NH? előállítása Lineáris védett Boc-D-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn- D-Pas(OBzl)-Arg(Tos)-D-Arg(Tos)-BHA peptidet állítunk elő a szokásos módon. A lineáris peptidet a gyantáról a védőcsoportok eltávolításával hasítjuk le. Ezt a műveletet a védett pepiidnek 1 ml anizol jelenlétében 10 ml folyékony hidrogén-fluoriddal 0 °C-on 50 percig való reagáltatásával végezzük el. A hidrogén-fluoridnak vákuumban való eltávolítása után a gyantát éterrel mossuk, majd levegőn szárítjuk. A gyantát ezután 60 ml 10%-os vizes ecetsavval, 60 ml 1%-os vizes ecetsavval, majd 60 ml vízzel mossuk. Az extraktumokat egyesítjük, vízzel meghígítjuk, majd liofilizáljuk. így 335 mg nyers lineáris peptidet nyerünk. A nyers lineáris peptidet ellenáramú megoszlásos eljárással (n-butanol:ecetsav: :víz= 4:1:5 elegy alkalmazásával) tisztítjuk. így 287,9 mg részlegesen tisztított lineáris peptidet nyerünk. 100 mg részlegesen tisztított peptidet G-15-ön, 10%-os vizes ecetsav alkalmazásával gélszűréssel tovább tisztítunk. így 38 mg tisztított lineáris peptidet nyerünk. 38 mg (33,9 /smól) lineáris peptidet 5 ml ecetsavban és 5 ml 1,8 mól/1 hidrogén-klorid-tartalmú ecetsavban oldunk. Az oldatot szárazra pároljuk, a visszamaradó anyagot bepároljuk. Ezt a műveletet összesen háromszor végezzük el. A visszamaradó anyagot 6 ml DMF-ban oldjuk és 7,4 pl (1,1 mólekvivalens) difenil-foszforil-azidot, majd 10,4 pl (2,2 mólekvivalens) trietilamint adunk hozzá a reakcióelegyet 3 napon át 4 “C hőmérsékleten tartjuk. Ezután további 3,7 pl (0,5 mólekvivalens) difenil-foszforil-azidot és 5,2 p 1 (1,0 mólekvivalens) trietil-amint adunk hozzá, és az elegyet 4 °C-on tartjuk éjszakán át. Ezután az elegyet szárazra pároljuk és a visszamaradó anyagot éterrel eldörzsöljük és a kapott terméket kiszűrjük. így nyers gyűrűs peptidet nyerünk enyhén higroszkópos szilárd anyag formájában. A kapott peptidet 2 ml metanolban oldjuk és preparatív HPLC eljárással Hamilton PRP-l-en (9 mm x 30 cm), 0,1% trifluor-ecetsav tartalmú 35%-os vizes acetonitril alkalmazásával tisztítjuk. A megfelelő frakciókat összegyűjtjük, szárazra pároljuk és 1%-os vizes ecetsavból liofilizáljuk. így 25,6 mg tisztított gyűrűs peptidet nyerünk. HPLC k’ - 5,0 (Hamilton PRP-1, mobil fázis: A 0,1% trifluor-ecetsav, B 0,1% trifluor-ecetsavat tartalmazó acetonitril, lineáris gradiens 20- -50% B, 15 perc, 50% B, 5 perc). 7. példa D-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-L-Pas-Arg-NH-) előállítása Lineáris védett Boc-D-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-L-Pas-(OBzl)-Arg(Tos)-BHA peptidet állítunk elő a szokásos módon. A lineáris peptidet a gyantáról a védőcsoportok eltávolításával hasítjuk le. Ezt a műveletet a védett peptidek 1 ml anizol jelenlétében 10 ml folyékony hidrogén-fluoriddal 0 °C-on 50 percig való reagáltatásával végezzük el. A hidrogén-fluoridnak vákuumban való eltávolítása után a gyantát éterrel mossuk, majd levegőn szárítjuk. A gyantát ezután 30 mi 50%-os vizes ecetsavval, 60 ml 10%-os vizes ecetsavval, 60 ml 1%-os vizes ecetsavval és 60 ml vízzel mossuk. Az extraktumokat egyesítjük, vízzel meghígítjuk, majd liofilizáljuk. így 564 mg nyers lineáris peptidet nyerünk. A gyantát DMF-dal ismét extraháljuk, az extraktumot szárazra pároljuk, és a visszamaradó anyagot 10%os vizes ecetsavból liofilizáljuk. így további 113 mg nyers lineáris peptidet nyerünk. 100 mg (103,7 mmól) nyers lineáris peptidet 10 ml ecetsavban és 2 ml DMF-ban oldunk. Az oldathoz 10 ml 1,8 mól/1 hidrogén-kloridot tartalmazó ecetsavat adunk. Az oldatot szárazra pároljuk, a visszamaradó anyagot DMF-ban oldjuk és szárazra pároljuk. Az oldás — bepárlás műveleteket összesen háromszor végezzük el. A viszszamaradó anyagot 20 ml DMF-ban oldjuk, és 22,5 pl difenil-foszforil-azidot (1,1 mólekvivalens), majd 31,7 pl trietil-amint (2,2 mólekvivalens) adunk hozzá. Az oldatot 3 napon át 4 °C- on tartjuk, majd további 10 pl (0,5 mólekvivalens) difenil-foszforil-azidot és 7,2 pl (0,5 mólekvivalens) trietil-amint adunk hozzá és a reakcióelegyet ezután szárazra pároljuk, a visszamaradó anyagot éterrel eldörzsöljük, és az elegyet szűrjük. így sárga, enyhén higroszkópos szilárd anyagot nyerünk. A kapott nyers gyűrűs peptidet ellenáramú megoszlásos eljárással, n-butanol:etil-acetát:ecetsav:víz = 2:2:1:5 elegy alkalmazásával, majd gélszűréssel (G-15, 10%-os vizes ecetsav) tisztítjuk. így 32,6 mg tisztított gyűrűs peptidet nyerünk. FAB - MS m/z 946 (MH + ). HPLC k’= 4,95 (Hamilton PRP-1, mobil fázis: A= 0,1%-os trifluor-ecetsav, B= 0,1% trifluor-ecetsavat tartalmazó acetonitril, lineáris gradiens 20 — 50% B, 15 perc; 50% B, 5 perc.) 8. példa D-Tyr(EO-Phe-VaI-Asn-Pas-Cad előállítása 0,04 mmól a 3B) példa szerint előállított ciklo-D-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-Pas-OH és 8 mg (0,04 mmól) mono-Boc-l,5-diamino-pentán 3 ml dimetil-formamidban készült oldatához hozzáadunk 8,2 mg (0,04 mmól) diciklohexil-karbodi-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 10
