199882. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új, vazopresszin antagonista hatású, polipeptidek és ezeket hatóanyagként tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
1 HU 199882 B 2 gczzük. A reakcióelegyet ezután vákuumban szárazra pároljuk, a visszamaradó anyagot vízmentes dietil-éterrel mossuk, és gáztalanított dimetil-formamiddal és 40%-os ecetsavval extraháljuk. Az extraktumokat egyesítjük, vákuumban szárazra pároljuk, majd 10%-os vizes ecetsavban felvesszük és liofílizáljuk. így a nyers lineáris peptidet nyerjük. Ezen a peptiden a NH2-D-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-Pas-OCH3-on az előzőekben ismertetett módon DPPA-val végrehajtott gyűrűzárás után nyerjük a cím szerinti metil-észtert. BOC-D,L-Pas-OCH3 helyett BOC-L-Pas-OCH3-t alkalmazva a fenti reakciólépések szerint és tisztítás után ez előzőekben izolált diasztereomerekkel együtt leuálódó ciklo/D-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-L-Pas/-OCH3-t nyerünk. FAB - MS: 805 (MH + ), 803 (MH'). Nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással Ultrasphere C —18® oszlopon a két diasztereomernek megfelelő 26,7, illetve 27,2 perc retenciós idejű csúcsot észlelünk. [Mozgó fázis: 0,1%-os vizes trifluor-ecetsav (a oldat) és 0,1%os acetonitriles trifluor-ecetsav (b) oldat) alkalmazásával 70% a oldat és 40% b oldat között 30 perc alatt kialakított gradiens, majd 10 percig 40% a oldat + 60% b oldat.] B) D-Tvr(EtVPhe-Val-Asn-Pas-QH előállítása 0,1 mmól, az A) lépés szerint előállított metilésztert dioxán és 10%-os vizes kálium-karbonát 1:1 arányú elegyében szuszpendálunk és a szuszpenziót szobahőmérsékleten 8 órán át keverjük. Ezután a reakcióelegyet vízzel meghígítjuk és jégecettel pH = 4-re savanyítjuk. A kapott oldatot vákuumban bepároljuk és a visszamaradó anyagot gélkromatográfiás eljárással tisztítjuk. C) D-TyrfEtVPhe-Val-Asn-Pas-QH előállítása 0,1 mmól, az 5(A) példa szerint nyert metilésztert metanol és 10%-os vizes kálium-karbonát 1:1 arányú elegyében szuszpendálunk és a szuszpenziót szobahőmérsékleten 8 órán át keverjük. A kapott oldatot vákuumban bepároljuk és a visszamaradó anyagot ellenáramú megoszlásos kromatografálással tisztítjuk (n-butanol, ecetsav és víz 4:1:5 arányú elegyét alkalmazzuk, 100 átvitel mellett). Nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással k’ = 12,6 (Ultrasphere ODS-n, az cluálást 0,1% trifluor-ecetsavat tartalmazó 70% víz/acetonitril és 0,1% trifluor-ecetsavat tartalmazó 40% víz/acetonitril között 30 perc alatt kialakított lineáris gradienssel végezzük). 4. példa D-Tyr(E;)-Phe-Val-Asn-DL-Pas-Arg-D-Arg-NH? előállítása Lineáris, védett Boc-D-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-DL-Pas(OBzl)-Arg/Tos)-D-Arg(Tos)-BHA-peptidet állítunk elő szokásos módon. A lineáris peptidet a védőcsoportok eltávolításával távolijuk el a gyantáról. Ezt úgy végezzük, hogy a védett peptidet 1 ml anizol jelenlétében 10 ml folyékony hidrogén-fluoriddal 1 °C-on 50 percig reagáltatjuk. A hidrogén-fluoridot vákuumban eltávolítjuk, a gyantát éterrel mossuk, majd levegőn szárítjuk. Ezután a gyantát 60 ml 10%-os vizes ecetsavval, 60 ml 1%-os vizes ecetsavval, majd 60 ml vízzel mossuk. Az extraktumokat egyesítjük, vízzel meghígítjuk, majd liofílizáljuk. így 324 mg nyers lineáris peptidet nyerünk. 275 mg lineáris peptidet ellenáramú megosztással (n-butanol:ecetsav:ví = 4:1:5) tisztítunk. így 166,7 mg tisztított lineáris peptidet nyerünk. 66,7 mg (59,6 /«mól) lineáris peptidet 5 ml ecetsavban és 5 ml 1,8 mól/1 hidrogén-kloridot tartalmazó ecetsavban oldunk. Az oldatot szárazra pároljuk, a visszamaradó anyagot egymást követően háromszor DMF-ban oldjuk, majd szárazra pároljuk. A visszamaradó anyagot 10 ml DMF-ban oldjuk, és 12,9 /il (1 mólekvivalens) difenil-foszforil-azidot, majd 18 /il (2,2 mólekvivalens) trietil-amint adunk hozzá. A reakcióelegyet három napon át 4 °C hőmérsékleten tartjuk, további 6,5 /il (0,5 mólekvivalens) difenil-foszforil-azidot és 9 /il (1,0 mólekvivalens) trietilamint adunk hozzá, majd éjszakán át 4 °C-on tartjuk. Ezután a reakcióelegyet szárazra pároljuk, és a visszamaradó anyagot éterrel eldörzsöljük. A kapott nyers gyűrűs peptidet kiszűrjük. Ez a nyerstermék enyhén higroszkópos szilárd anyag. A peptidet 5 ml metanolban oldjuk és preparatív HPLC eljárással, Hamilton PRP-l-en (9 mm x 30 cm), 0,1% trifluor-ecetsavat tartalmazó 33%-os vizes acetonitril alkalmazásával tisztítjuk. A megfelelő frakciókat összegyűjtjük, szárazra pároljuk, és a maradékot 1%-os vizes ecetsavban felvéve liofílizáljuk. így 45 mg tisztított gyűrűs peptidet nyerünk. FAB — MS m/z 1102,8 (MH + ); HPLC k’= 5,0 (Hamilton PRP —1, mobil A fázis 0,1% trifluor-ecetsav, B fázis 0,1% trifluor-ecetsav-tartalmú acetonitril, lineáris gradiens 20 — 50% B fázis, 15 perc; 50% B fázis, 5 perc). 5. példa D-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn -1 — Pas- Arg- D-Arg-NH? előállítása Lineáris védett Boc-D-Tyr(Et)-Fhe-Val-Asn-L-Pas(Obzl)-Arg(Tos)-D-Arg(Tos)-BHa peptidet állítunk elő a szokásos módon. 2,0 g peptid-tartalmú gyantáról a peptidet a védőcsoportok eltávolításával lehasítjuk. Ezt a műveletet úgy végezzük, hogy a védett peptidet 2,0 ml dimetil-szulfíd jelenlétében 40 ml folyékony hidrogén-fluoriddal 0 °C-on 60 percig reagáltatjuk. A hidrogén-fluoridot vákuumban eltávolítjuk, majd a gyantát éterrel mossuk, 50%-os vizes ecetsavval, 20%-os vizes ecetsavval, majd vízzel mossuk. Az extraktumokat egyesítjük, majd liofílizáljuk. így 1,07 g nyers lineáris peptidet nyerünk. A kapott 1,07 g (956 /nnól) nyers, lineáris peptidet HPLC eljárással Vydac ODS-en 25% acetonitrilt tartalmazó 0,1 mól/l-es trietil-ammónium-foszfát eluens alkalmazásával tisztítjuk. A tisztított peptidet ezután SM —2 oszlopon adszorbeáljuk, 0,05 mól/l-es hidrogén-kloriddal mossuk, majd 90%-os vizes metanollal eluíljuk az oszlopról. így 358 mg lineáris peptidet nyerünk hidrogén-klorid sója formájában. 125 mg (108 /«mól) lineáris peptidet 21 ml 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 9
