199880. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 15-ös helyzetben levő lizin helyén más aminosavakat tartalmazó aprotinin homológok és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 199880 B 2 észtert tartalmazó eluátum frakciókhoz normál nátrium-hidroxid oldatot adunk, amíg a pH 4,5 nem lesz, és vákuumba ni 0 ml-re bepároljuk. b) Dez-Lys-aprotininl-pentametilészter Az a) pontban kapott kondenzátumhoz 0,1 n nátrium-hidroxid oldatot adunk, amíg a pH 6,2 nem lesz, majd egy karboxipeptidáz B szuszpenzió 50 /»1-ét adjuk az oldathoz. Az oldatot 30 percig szobahőmérsékleten tartjuk, majd 0,5 ml ecetsavat adunk hozzá. A karboxipeptidáz elválasztása céljából az oldatot 0,05 mólos, sósavval pH “ 2-re beállított ecetsavval egy Sephadex G —50 oszlopon (2x120 cm) szűrjük, és az aprotinin származékot tartalmazó eluátum frakciókat nátrium-hidroxid oldattal pH= 4-re állítjuk és vákuumban 10 ml-re bepároljuk. Ennek az oldatnak a sómentesítését egy Bio-Gel P —2 oszlopon (2x100 cm) történő szűréssel végezzük. A megfelelő eluátumok liofilizálásával 85 mg aprotinin-pentametilésztert kapunk. 3. példa L-Valin-15-Aprotinin a) L-Valin- 15-aprotinin--hexametilészter 13 mg (2 /imól) a 2. példa szerint előállított dez-lizin-15-aprotinin -pentametilészter és 167 mg L-valin-metilészter-hidroklorid (1 mmól) 7,5 ml vizes oldatához 20 °C-on 96 mg (500 /mól) N-etil-N’-(3-dimetil-amino-propil)-karbodiimid-hidrokloridot adunk. 0,1 n sósav hozzáadásával, autotitrátor segítségével a reakcióoldat pH értékét állandóan 4,75-ön tartjuk. 2 óra után a reakcióelcgyben lévő kismolckulájú anyagokat az elegynek Sephadex G —25 oszlopon (1,5x100), 0,1 mólos ecetsav eluálószerrel történő gélszűrésével eltávolítjuk. A proteintartalmú eluátomok liofilizálásával, kvantitatív termeléssel egy színtelen anyagot kapunk. b) L-valin-15-aprotinin-pentametilészter A 3a. példa szerint nyert liofilizáll anyagot 15 ml 8,5 pH-jú, 0,01 mólos tris-(hidroxi-metil)-amino-metán-sósav-pufferban, 24 órán át, 12,5 ml Tripszin-Sepharose 4 B-vel - töltet: 5 mg tripszin pro ml gél - enyhén rázogatva inkubálunk. Azután az elegy pH-ját 0,1 n sósavval 1,8- ra állítjuk és az affinitásadszorbenst szűréssel elválasztjuk és összesen 20 ml 2 pH-jú, 0,1 mólos ecetsav-sósav oldattal kimossuk. A szűrletet és a mosófolyadékot egyesítjük, és az oldatot, miután pH-ját normál nátrium-hidroxiddal 4-re állítottuk, vákuumban 10 ml-re bepároljuk. A koncentrátumot egy Sephadex G-25 oszlopon (1,5x100 cm) történő szűréssel sótalanítjuk. A proteintartalmü eluátumok liofilizálásakor 143 mg anyagot kapunk. c) L-valin- 15-aprotinin A 3b. példa szerint nyert anyagot 10 ml 0,001 n nátrium-hidroxid oldatban oldunk. 12 órás 21 °C-on történő állás után az oldatot 0,01 n sósavval semlegesítjük, és 550 mg hidroxil-ammónium-klorid hozzáadása után 6 órán át szobahőmérsékleten tartjuk. Az oldatot egy 8,6 pH-jú 0,01 mólos borátpufferrel egyensúlyba hozott CM - Sephadex C - 25 oszlopra (2x40 cm) visz* szűk. Az oszlopot a fenti borátpuffer oldat és nátrium-kloridra 0,4 mólos fenti borátpuffer oldat lineáris gradiensével eluáljuk. A granulocitaelasztáz-gátl > eluátumokat — amelyek 0,25 mólos nátrium-klorid koncentrációnál eluálódnak - egyesítjük és az oldatot bepárlás után egy Bio —Gel P—2 oszlopon (1,5x100 cm), 0,1 mólos ecetsav eluálószerrel történő gélszűréssel sótalanítjuk. Liofilizálás után 5,7 mg valin-15-aprotinint kapunk. (45% a felhasznált dez-lizin-15-aprotinin -pentametilészterre vonatkoztatva.) Relatív elektroforetikus mozgékonyság: 0,54. 4, példa L-Leucin-15-aprotinin A valin-15-aporotinin szintéziséhez hasonlóan 13 mg (1 /imól) dez-lizin-15-aprotinin’-pentametilésztert és 92 mg L-leucinmetilészter-hidrokloridot (500 /tmól) 58 mg (300 /tmól) N-elil-N’-(3-dimetil-amino-propil)-karbodiimid-hidroklorid segítségével kondenzálunk. A reakcióoldatot 50 ml 0,05 mólos, 8,5 pH-jú trisz-(hidroxi-metil)-amino-metán-sósav pufferrel hígítjuk és 20 ml a-Chimotrypsin-Sepharose Cl-4B-t - töltet: 7 mg enzim gél ml-enként — adunk az elegyhez. 24 órás enyhe rázogatás után az affinitáshordozót leszűrjük, és a gélt a fenti pufferral és végül 250 ml vízzel alaposan kimossuk. Az a-Chymotrypsin-Sepharose Cl-4B-t 50 ml 0,1 mólos ecetsavban szuszpendáljuk és 0,1 normál sósavat adunk hozzá, amíg a pH 1,8 nem lesz. 20 percnyi állás után újra leszűrjük és a hordozót összesen 100 ml 0,1 mólos ecetsavval több részletben mossuk. Az egyesített szűrletet, miután normál nátrium-hidroxid oldattal pH = 3-ra állítottuk be, vákuumban kb 5 ml-re bepároljuk, és a koncentrátumot 0,1 n nátrium-hidroxid oldattal semlegesítjük. 0,5 ml 0,05 n nátrium-hidroxid oldat hozzáadása után ezt az elegyet egy éjjelen át 20 °C-on állni hagyjuk és 14 óra után 0,1 mólos ecetsavoldattal semlegesítjük. 300 mg hidroxil-ammónium-klorid hozzáadása után az oldatot 4 órán át szobahőmérsékleten tartjuk. Az oldatot egy Sephadex G-25 oszlopon (1,5x100 cm) végzett gélszflréssel sótalanítjuk és a proteintartalmú eluátumokat egyesítjük és liofilizáljuk. 7,8 mg színtelen anyagot kapunk (~ 58%). Relatív elektroforetikus mozgékonyság: 0,58. 5. példa Glicin-15-aprotinin a) Glicin-15-aprotinin--hexametilészter 13 mg (2 /tinói) dez-lizin-15-aprotinin’-pentámetilésztert 125,5 mg (1 /imól) glicin-metilészter-hidrokloriddal, a 3a. példában leírt módon, 94 mg (750 //mól) N-etil-N’-(3-dimetil-amino-propii)-karbodiimid-hidroklorid segítségével kondenzáltatunk, és a glicin-15-aprotinin*-hexametilésztert az ott leírt módon, kvantitatív kitermeléssel izoláljuk. b) Glicin-15-aprotinin Az 5a. példa szerinti eljárással kapott anyag 10 ml, 3,7 pH-jú, 0,05 mólos foszfátpufferes oldatához 0,25 ml olyan 0,1 mólos kálcium-klorid-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 10
