199880. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 15-ös helyzetben levő lizin helyén más aminosavakat tartalmazó aprotinin homológok és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 199880 B 2 oldatot adunk, amelynek a pH-ját 1 n nátrium•hidroxid oldattal 6,0-ra állítjuk, és ezután 60 mg (2 /imól) szarvasmarhatripszint (80%-os) adunk hozzá. 30 percnyi 20 °C-on történd állás után az oldat pH értékét 1 n nátrium-hidroxid oldattal 8,0-ra állítjuk, és egyrészt a tripszin és a tripszinglicin-15-aprotinin-pentametilészter-komçlex, másrészt az inaktív dez-lizin-15-aprotinin származékok elválasztása céljából, 0,05 mólos, 7,5 pH-jú trisz-(hidroxi-metil)-amino-metán-sósavpuffer eluálószerrel egy Sephadex G — 50 oszlopon (2x100 cm) szűrjük. A komplexet, illetve a tripszint tartalmazó eluátumokat egyesítjük és 2,5 ml 0,1 n nátrium-hidroxid oldatot adunk hozzá. A reakcióoldatot 14 órás 22 °C-on történő állás után 1 mólos ecetsavval semlegesítjük és vákuumban 10 ml-re bepároljuk. A koncentrátumhoz 550 mg hidroxil-ammónium-kloridot adunk és az oldatot 4 órán át szobahőmérsékleten hagyjuk. Az oldat pH értékét koncentrált sósavval pH » 2-re állítjuk és az elegyet, a képződő csapadék előzetes eltávolítása nélkül, egy Sephadex G —50 oszlopra (2x100 cm) visszük. Az oszlopot 2 pH-jú, 0,1 mólos ecetsav-sósav oldattal fejlesztjük ki. A glicin-15-aprotinint tartalmazó eluátum frakciókból bepárlás és Bio — Gel P — 2 oszlopon (1,5x100 cm) gélszűréssel történő sótalanítás után, liofilizálással 8,3 mg (64%) színtelen anyagot kapunk. 6. példa L-Arginin-15-aprotinin a) L-Arginin-15-aprotinin-oligometilészter 13 mg (2 /imól) dez-lizin-15-aprotinin -pentametilésztert 130,5 mg (500 /xmól) L-arginin-metilészter-dihidrokloriddal 57 mg N-etil-N’-(3-dimetil-amino-propil)-karbodiimid-hidroklorid jelenlétében, a 3a. példában leírt módon reagáltatjuk. Ezután 1 n nátrium-hidroxid oldat hozzáadásával az oldat pH értékét 7,5-re állítjuk, és 1 ml 0,1 mólos kálcium-klorid oldatot és 80 ml, 7,5 pH-jú, 0,05 mólos trisz-(hidroxi-metil)amino-metán-sósav-puffert adunk hozzá. A pH érték utánaállítása után 20 ml Trypsin-Sepharose Cl - 4B-t - enzimtartalom: 5 mg gél ml-enként — adunk az oldathoz és a szuszpenziót 15 órán át enyhén rázzuk. Azután az affinitáshordozót leszűrjük és a gélt 50 ml fenti pufferral és végül 100 ml vízzel mossuk. A trypsin-Sepharose-t 100 ml 1,8 pH-jú, 0,1 mólos ecetsav-sósavban szuszpendáljuk. A pH érték utánaállítása után 20 percig enyhén rázzuk és újra szűrjük. Az affinitásgélt 100 ml, 1,8 pH-jú, 0,1 mólos ecetsav-sósav oldattal, több részletben, alaposan mossuk. Az egyesített szűrleteket, a pH értéknek normál nátrium-hidroxid oldattal pH» 4,5-re történt beállítása után kb. 10 ml-re bepároljuk, miután előzőleg 5 ml normál nátrium-hidroxid oldatot adtunk hozzá. A kocentrátumot 0,1 mólos ecetsav eluálószerrel egy Sephadex G — 25 oszlopon (2x100 cm) szűrjük. A proteintartalmú eluátum frakciókból liofilizálással 9,6 mg (76%) arginin-15-aprotinin-oligometilésztert nyerünk. b) L-Arginin-15-aprotinin A 6a. példa szerinti eljárással kapott anyagot 10 ml 0,001 mólos nátrium-hidroxid oldatban oldjuk és ezt az oldatot 24 órán át 20 °C-on tartjuk. Azután 0,1 mólos sósavval semlegesítjük és 500 mg hidroxil-ammónium-kloridot adunk az oldathoz. Az elegyet 3 órán át szobahőmérsékleten állni hagyjuk, majd az oldatot sótalanítás céljából, 0,1 mólos ecetsav eluálószerrel egy Sephadex G-25 oszlopon (2x100 cm) szűrjük. A proteintartalmú eluátum frakciókat bepárlás után liofilizáljuk. így 8,2 mg (86%, illetve 65% a dez-lizin- 15-aprotinin-pentametilészterre vonatkoztatva) színtelen anyagot kapunk, melynek a relatív elektroforetikus mozgékonysága 1,05 és HPLC-n a relatív retenciós ideje 1,13. 7. példa L-Norleucin- 15-aprotinin A 13 mg (2 /*mól) dez-lizin- 15-aprotinin*pentametilészternek és 55 mg (300 /imól) L-norleucin-metilészter-hidrokloridnak 83 mg (200 /jmól) N-ciklohexil-N’-[2-(4-morfolinil)-etilJ-karbodiimid-metil-p-toluolszulfonáttal a 3a. példában ismertetett eljárással analóg módon végzett reakciójában nyert anyagot, a norleucin 15 és az alanin 16 közötti peptidkötés szintézise céljából, 50 ml, 8,0 pH-jú 0,1 mólos trisz-(hidroxi-metil)-amino-meián-sósav-pufferban 20 ml Chymotrypsin-Sepharose CL —4B-vel — töltet: 7 mg enzim gél ml-enként — 6 órán át inkubáljuk. A gélt a fenti inkubációs pufferral és végül 100 ml vízzel mossuk. Ezután 50 ml, 1,89 pH-jú 0,1 mólos ecetsav-sósav oldatban szuszpendálunk, a gélt és a folyadékot szűréssel elválasztjuk. Az affinitásgélt 100 ml 0,05 mólos ecetsav-sósav oldattal újra mossuk és az egyesített szűrleteket, miután annyi ammónium-hidroxid oldatot adtunk hozzá, hogy a pH 4,0 legyen, vákuumban 10 ml-re bepároljuk. A koncentrátumot semlegesítjük és 550 mg hidroxil-ammónium-klorid hozzáadása után 3 órán át szobahőmérsékleten hagyjuk. Sótalanítás céljából az oldatot, 0,1 mólos ecetsav eluálószerrel, egy Bio-Gel P — 2 oszlopon (2x100 cm) szűrjük. A proteintartalmú eluátum frakciókat bepároljuk és liofilizáljuk. 9,2 mg (71%) színtelen anyagot kapunk. __ 8. példa Norvalin- 15-aprotinin A 13 mg (2 /imól) dez-lizin-15-aprotinin*pentametilészternek és 67 mg (400 /jmól) L-norvalin-metilészter-hidrokloridnak 58 mg (300 /tmól) N-etil-N’-(3-dimetil-amino-propil)-karbodiimid-hidroklorid jelenlétében végrehajtott kondenzációjában kapott anyagkeveréket a 4. példában megadott módon feldolgozzuk. A 15. és 16. rész közötti amidkötés létrehozására 20 ml Pankreaselastase-Sepharose CL—4B-t — töltet: 4 mg enzim gél ml-enként - 0,05 mólos, 5,2 pH- jú foszfátpufferban használunk. A 7. példában leírt eljárással analóg további feldolgozás során 7,1 mg (60%) színtelen liofilizátumot kapunk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 11
