199880. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 15-ös helyzetben levő lizin helyén más aminosavakat tartalmazó aprotinin homológok és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására

1

HU 199880 B

2

1. Táblázat

Az aprotinin és néhány homológ aminosav összetétele Spackman, Stein és Moore, 1985, Anal. Chem. 30,1190

szerint1^

Amino-Aprotinin

Argls-Aprotinin

Gly1

^-Aprotinin

Val^-Aprotinin

sav

(elméleti)

talált

elméleti

talált

elméleti

talált

elméleti

Asp

5

5,08

5

4,98

5

5,03

5

Thr

3

2,93

3

2,95

3

2,89

3

Ser

1

1,38

1

1,38

1

1,04

1

Glu

3

2,93

3

2,93

3

2,79

3

Pro

4

3,76

4

3,81

4

3,81

4

Gly

6

6,00

6

7,02

7

6,00

6

Alá

6

5,89

6

6,00

6

5,79

6

Cy*

6

5,13

6

4,88

6

5,01

6

Val

1

0,62

1

0,95

1

1,94

2

Met

1

0,65

1

0,55

1

0,70

1

Ile

2°

1,15

2

1,18

2

1,36

2

Leu

2

1,93

2

1,89

2

2,01

2

Tyr

4

3,66

4

3,37

4

3,58

4

Phs

4

4,04

4

3,68

4

3,84

4

Lys

4

2,58

3

3,02

3

2,95

3

Arg

6

6,80

7

5,74

6

5,96

6

akrilamid helyett azonban 7% akrilamidot használtunk. Az aprotinin homológok elektroforetikus mozgékonyságát az aprotininére, mint standardra vonatkoztattuk.

4. Preteináz gátlási spektrum a) Elasztáz-gátlás a) Hasnyálmirigy-elasztáz-gátlás A jelen találmány szerinti aprotinin homológokkal végzett gátlási kísérletekhez az Fa. Nutrional Biochemicals Corp. kristályos hasnyálmirigy-elasztázát (sertés) használtuk. Szubsztrátként szukcinil-L-alanil-L-alanil-L-alaninp-nitro-analidet alkalmaztunk (J. Bieth et al. Biochek. Med. 11, 350 (1974)]. A hasítás mértékét a felszabaduló p-nitro-anilin extinkciójának 405 nm-en történő folyamatos mérésével határoztuk meg. Hogy a maximális komplexképződést biztosítsuk, az enzimet és az inhibitort a szubsztrát hozzáadása előtt 15 percig előzetesen inkubáltuk. A 2. táblázatban egyes új inhibitoroknak az enzimet gátló hatását mutató szemikvantitatív adatokat állítottuk össze.

0) Granulocita-elasztáz-gátlás A gátlási vizsgálatokhoz alkalmazott izoenzimkeveréket K. Ohlsson és I. Olsson [Europ. J. Biochem. 42, 519 (1974)] szerint humán granulocitákból nyertük. Szubsztrátként különösen a szukcinil-L-alanil-L-alanil-L-valin-p-nitroanalid [H. R.Wenzel et al., Hoppe Seyler’s Z. Physiol. Chem. 361,1413 (1980)] alkalmas. Néhány, a jelen találmány szerinti aprotinin homológnak a granulocita-elasztázra gyakorolt gátló itatását mutató adatokat a 2. táblázatban adjuk meg.

1) mólarányok a Gly« 6,0-ra, illetve a Gly15- -aprotinné az Alá = 6,0-ra vannak vonatkoztatva

°) Az izoleucinértékeket a molekulában lévő lle-Ile-kötés miatt, 18 órás hidrolízis után túl alacsonynak találtuk. 30

A jelen találmány szerint előállított inhibitorokat kémiai, fizikai kémiai, biokémiai valamint biológiai tulajdonságaikkal jellemezhetjük. A következő kritériumokat használtuk fel:

1. Aminosavösszetétel 35

Az aminosavösszetételt S. Moore, D. H.

Spackman, W. H. Stein [Anal. Chem. 30, 1185 (1958)] alapján határoztuk meg. Néhány, a jelen találmány szerinti aprotinin homológ aminosavanalízisének értékei példaként az 1. táblázatban 40 vannak összeállítva.

2. Nagynyomású folyadékkromatográfia

A HPLC-t egy Hewlett-Packard (HP) 1084B készülékkel, 4x300 mm-es Bio-Sil TSK IEX 530 CM-oszloppal (Bio-Rad Labs, Richmond, USA) 45

végeztük. Az áramlási sebesség 1 ml/perc volt,

0,15 mól nátrium-szulfátot és 0,6 mól nátriumszulfátot tartalmazó 7-es pH értékű pufferek (Fixánál 38746 Riedel de Haen) lineáris gradiensével, 40 cC-os oszlophőmérsékieten, mintegy 50

50 bar nyomáson dolgoztunk. Menetenként 1 mg aprotinin származék 1 ml vizes oldatából 20 ^1-t vittünk fel, 215 és 280 nm-nél detektáltunk. Belső standardként aprotinint használtunk, a megadott retenciós idők aprotininre vonatkoznak. 55

3. Elektroforézis

Az elektroforéziseket a Jering és H. Tschesche [Eur. J. Biochem. 61,442 (1967)] által megadott körülmények között végeztük. 10%

6