199880. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 15-ös helyzetben levő lizin helyén más aminosavakat tartalmazó aprotinin homológok és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 199880 B 2 b) Kimotripszin-gátlás A kimotripszin aktivitását W. Nagei et a., Hoppe-Seylers Z. Physiol. Chem. 340, 1 (1965) szerint fotometriásan, szukcinil-L-fenil alanin-pnitroanilid szubsztráttal határoztuk meg, a hidrolízist pedig a felszabadított p-nitro-anilin extinkciójának 405 nm-en történő folyamatos mérésével követtük. A szubsztrát hozzáadása előtt az enzimet és az inhibitort a vizsgálathoz használt pufferban 15 percig inkubáltuk. Néhány, a jelen találmány szerint előállított aprotinin homológnak a kimotripszinre gyakorolt gátló hatására vonatkozó adatokat a 2. táblázat tartalmazza. c) Kaiepszin G-gátlás A katepszin G aktivitását szukcinil-L-fenilalanin-/?-naflilészter szubsztráttal, az enzimatikus hasításkor felszabaduló /?-naftolnak 328,5 nm-nél történő folyamatos spektroszkópiás mérésével határoztuk meg. Az enzimreakciót 0,25 mólos, 7,2 pH értékű (tisz-hidroxi-metil-amino-metán)-sósav pufferben végeztük, amely 0,05% Brij 35-öt tartalmaz és magnézium-kloridra 0,005 mólos. Az enzimnek és az inhibitornak 2,5 ml vizsgálathoz használt pufferben végzett 15 perces előzetes inkubációja után, a 39,4 mg szubsztrátnak 1 ml dimetil-szulfoxiddal készített törzsoldatából 0,025 ml-t adunk hozzá és az extinkció emelkedését 328,5 nm-nél meghatároztuk. Ebből az extinkciós értékből a spontán hidrolízisből eredő extrinkciónövekedést levontuk. A jelen találmány szerint előállított néhány aprotinin homológra vonatkozó eredményt a 2. táblázat tartalmaz. d) Tripszin-gátlás A tripszin aktivitását H. Fritz et al. [Methoden der enzymatischen Analyse, kiadó H. W. Bergmeyer, 2. kiadás, 1. kötet 1011. old. (1970)] alapján, benzoil-L-arginin-p-nitro-anilid szubsztráttal határoztuk meg. A felszabadított pnitro-anilint 405 nm-nél spektrofotometriásán mértük. Az enzimet és az inhibitort a szubsztrát hozzáadása előtt 15 percig inkubáltuk. A 2. táblázatban megtalálhatók néhány, a jelen találmány szerint előállított aprotinin homológnak a tripszinre gyakorolt gátló hatására vonatkozó adatok. e) Hasnyálmirigy-kininogenáz-gátlás hasnyálmirigy-kallikrein Tesztenzimként hasnyálmirigy kallikreint (sertés) alkalmaztunk. Az enzimaktivitás meghatározását D-valil-L-leucil-L-arginin-p-nitro-anilid (A.B.Kabi) szubsztráttal, T. Dietl et al. [Hoppe/Sezler’s Y. Phzsiol. Chem. 360, 67 (1979)] szerint végeztük. A szubsztrát hozzáadása előtt az enzimet és az inhibitort 15 percig inkubáltuk. A hidrolízist spektrofotometriásán, a felszabadított p-nitro-anilinnek 405 nm-en történő meghatározásával követtük. A sertés-hasnyálmirigy-kallikrein gátolhatóságára vonatkozó adatok a 2. táblázatban találhatók. f) Kollagenáz-gátlás A granulocitakoilagenázt H. W. Macartney és H. Tshesche [FEBS Letters 119, 327 (1980)] szerint humán leukocitákból izoláltuk és az enzimaktivitást a fenti munkában megadott eljárással határoztuk meg. A 2. táblázatban kvalitatfve megadtuk a granulocitakollagenáznak néhány, a találmány szerint előállított aprotinin homológgal való gátolhatóságát. g) Xa faktor-gátlók Humán X faktort a Boehringer cégtől vásároltuk — 5E 0,5 mi ben —. Szubsztrátként benzoil- L-izoleucil-L-glutamil-glicil-L-arginin-p-nitro-anilidet (S-2222 Fa. A.B.Kabi) használtunk. Az enzimaktivitást a p-nitro-anilin felszabadítás alapján, az enzim és az inhibitor 10 perces előzetes inkubációja után határoztuk meg. A 2. táblázat tartalmazza a jelen találmány szerint előállított néhány aprotinin homológ hatékonyságára vonatkozó adatokat. h) Plazmin-gátlás Néhány, a jelen találmány szerint előállított aprotinin homológ plazmingátló hatása kvalitatíve a 2. táblázatból látható. A meghatározásokat humán plazminnal, D-valil-L-leucil-L-lizin-p-nitro-anilid szubsztrát (S-2251; Fa. A. B. Kabi) alkalmazásával, az enzimnek és az inhibitornak 0,05 mól nátrium-kloridot tartalmazó, 7,4 pH értékű, 0,1 mólos trisz-(hidroxi-metil)-amino-metán — sósav pufferben történő 10 perces előzetes inkubációja után végeztük. A jelen találmány szerint előállított aprotininhomológok akut gyulladási reakció modelleken hatékonyabbak az aprotininnél, minthogy velük nemcsak hogy jelentősen kisebb dózissal ugyanaz a hatás érhető el, mint aprotininnél, hanem a gyulladási reakciót akkor is jelentősen gátolják, ha több órával a gyulladásos kór kiváltása után adják be őket. Ilyen terápiás hatás az aprotininnel kaolin- és aeroszil modellen, egyszeri beadással nem érhető el. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 7
