199880. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 15-ös helyzetben levő lizin helyén más aminosavakat tartalmazó aprotinin homológok és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 199880 B 2 portok egy része elhidrolizál. Teljes hidrolízis történik 0,001 N — 1,0 N alkálifémhidroxid oldatokban történő állás során, mind +4 °C-on, mind pedig szobahőmérsékleten. Különösen akkor, ha a IS és 16 helyzetű aminosavak közötti peptidkötés kialakítását hordozóhoz kötött enzimekkel végezzük, nem szükséges az aprotinin-homológokat az elszappanosítás előtt tisztítani. A kísérő anyagok, mint a változatlan kiindulási anyag és az adott esetben képződő több molekulából álló aggregátumok, mindenek előtt azonban a 14 helyzetű félcisztinrészen a karbodiimides kondenzációkor képződő acilkarbamidok inhibitorként hatástalanok, és szűréssel eltávolíthatók. A karbodiimides kondenzáció során részben képződő tirozin-O-izokarbamid-származékok 0,5 mólos hidroxil-aminnal 7,0 pH-n, 2 — 6 órás inkubációs időt alkalmazva ismét szubsztituálatlan tirozinrésszé alakíthatók vissza [v.ö. K. L. Carraway és D. E. Koshland, Jr., Biochim. Biophys. Actá 160, 2727 (1968)]. A szuszpenziónak 1,5 és 3 közötti pH értékekre történő savanyításakor az aprotinin-homológokat felszabadítjuk komplexeikből, és a szűrletbe kerülnek. Ha azonban a 15 — 16 kötést oldható enzimmel alakítjuk ki, ajánlatos az enzimeket, önmagában ismert módon, savas kicsapással, vagy gélkromatográfiával elválasztani. A reaktív centrumban lévő 15/16 peptidkötés újraszintetizálása jól véghezvihető vízoldható karbodiimidek segítségével is, 3-7, előnyösen 4,5 és 5 közötti pH értékeken, és különösen jól hidroxiszukcinimid jelenlétében. Ehhez mindenesetre az észtercsoportokat, előnyösen az újonnan bevezetett 15 helyzetű aminosav észtercsoportjait el kell hidrolizálni, amit — miként korábban leírtuk nátronlúggal, vagy észterolitikus aktivitásuk miatt, megfelelő proteinázokkal végezhetünk. A peptidkémiailag elvégzett újratzintézissel szemben a kívánt homológok alacsonyabb kitermelése és nem kívánatos melléktermékek képződése intra- és intermolekuláris kondenzációs reakciók, valamint karbodiimideknek a karboxilcsoportokra történő, acilkarbamidok képződésével járó addíciója révén. Az inhibitorként aktív és az inhibitorként inaktív anyagok úgy is könnyen elválaszthatók, hogy az enzimatikus kondenzáció során keletkező reakcióoldatot először semleges, illetve lúgos körülmények között gélszűréssel frakcionáljuk. Az aprotinin homológ csak a komplexet tartalmazó frakciókban eluálódik. Az oldatnak 1 és 4 közötti pH értékekre történő beállítása után az enzim-inhibitorkomplex disszociál és az enzim is az inhibitor egy újabb, savas körülmények között véghezvitt gélszűréssel elválasztható. Ezekhez a szűrésekhez előnyösen használható oldószerek az ecetsav, hangyasav vagy vizes ásványi savak is, vagy ezeknek az olddószereknek a keverékei. Különösen előnyös, ha a találmány szerinti inhibitorok izolálása és tisztítása céljából kihasználjuk a proteinázok iránt mutatott nagy affinitásukat. Ez' célszerűen vagy az első, kémiai kondenzációs lépés, vagy pedig a második, enzimatikus átalakítás után, affinitás kromatográfiás eljárás alkalmazásával végzett frakcionálással történik. Affinitásadszorbensként többnyire szilárd inert anyagokat (hordozókat) használunk, amelyek felületére a megfelelő enzimeket önmagában ismert eljárással rávisszük. A reakcióelegy felvitelekor és az azt követő eluálása során az inhibitorként hatástalan anyagok azonnal, az inhibitorként hatásos anyagok viszont lassan eluálódnak, vagy egészen az adszorbensen maradnak. A hordozóhoz kötött enzim és az inhibitorok közötti kötések az eluálószer pH értékének és/vagy a sókoncentrációjának a változtatásával felbonthatók, úgyhogy végül a keverék inhibitorként aktív komponenseit az eluátumban megkapjuk. A gélszűrés és az affinitás kromatográfia mellett különösen az ioncserélőkromatográfia alkalmas a reakcióelegyek sótalanítására és frakciónálására. Az új, találmány szerinti aprotinin-homológok, amelyek az aprotinintől csak a 15 helyzetű aminosavrészben különböznek, a megváltozott gátlási spektrumra visszavezethető okból megváltozott hatású és működésű értékes proteinázinhibitorok. A találmány szerinti aprotinin-homológok gátlási spektrumának változásai attól függnek, hogy az aprotinin aktív centrumában a Lys15 részt olyan aminosavakra cseréljük, amelyeknek az oldalláncai jobban megfelelnek a megfelelő proteinázok szubsztrátzsebének. Powers és Zimmermann munkacsoportjának szintetikus szubsztrátumok és inhibitorok granulocitaelasztázhoz, hasnyálmirigyelasztázhoz, kimotripszinhez és katepszin G-hez való affinitásának vizsgálatánál kapott eredményei alapján meglepő a Leu15-aprotininnek és ugyanúgy a norleucin15- aprotininnek az említett enzimeken észlelt gátló hatása és a 15 helyzetben valint tartalmazó homológ viszonylag nagy szelektivitása a granulocitaelasztázhoz, valamint a kollagenázgátlása. Meglepő azonkívül, hogy az Ala15-aprotinin mindkét elasztázt csak gyengén gátolja. Említésre méltő a Gly15-aprotinin kiváló antitriptikus hatása is és a szöveti kininogenáz (kallikrein) meglepő gátlása. A találmány szerinti inhibitoroknak az aprotininnel szemben előnyös biológiai tulajdonságai vannak. Különösen előnyös a hasnyálmirigy és granulocita elasztázokra, valamint a katepszin G-re és a granulocitakollagenázra gyakorolt gátló hatásuk, amely új terápiás felhasználási lehetőségeket nyit meg. A hasnyálmirigyelasztáznak fontos szerepe van a pankreatitisben, a szérumelasztáznak az atherosclerosisban és a granulocitaelasztáznak a kötőszövetkárosodással járó akut és krónikus gyulladásoknál, érfalkárosodásoknál, valamint necrotizáló megbetegedéseknél és a tüdőszövet degenerációjánál, például emphysema esetén. Hasonlóan fontos a lysosomális enzimek és különösen a granulocitaelasztáz szerepe immunológiai gyulladási reakcióknál, például rheumatoid arthritis esetén. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
