199860. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gangliozid-származékok és ilyen hatóanyagot tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
1 HU 199860 B 2 5 g mennyiséget (amelyet szarvasmarha agyszövetekből extrakcióval állítottuk elő a 2. példában leírtak szerint) 200 ml oldószerelegyben oldottunk, amely diklórmetán és metanol 4:1 arányú vízmentes elegyéből áll. 50 ml vízmentes metanolban oldott 318 mg (5,86 mM) nátriummetilátot adunk hozzá, és az elegyet 2 órán át forraljuk visszafolyató hűtő alatt A nyers reakcióterméket ezután az 1. példában ismertetett módon különítjük el. A kapott 4,9 g nyers terméket kromatográfiás úton tisztítjuk Sephadex-DEAE A-25 (acetát alakban lévő) oszlopon, oldószerként kloroform, metanol és víz 30:60:8 arányú elegyének alkalmazásával. Az elegyített semleges frakcióka bepároljuk, vízben dializáljuk, szárazra pároljuk, a maradékot kloroform és metanol 1:1 arányú elegyének 15 ml mennyiségében oldjuk, és a terméket 75 ml acetonnal kicsapjuk. 4,3 g terméket kapunk. Az infravörös spektroszkópia, amelyet káliumbromid pasztillákon végeztünk, az észter jellemző sávját mutatta 1750 cm’1-nél. Az 1. példában leírt módon végzett kromatográfia azt mutatta, hogy a termék gangliozidok metilésztereinek keveréke 0,72-0,85 Rfértékkel (a gangliozidkeverék Rf-értéke 0,2-07). Azt, hogy az átésztereződés teljesen végbement, olymódon erősíthetjük meg, hogy meghatározzuk az alkoxi- és szialinsavcsoportok közötti moleulaarányt Ehhez a terméket 1 órán át kezeltük 0,1 N nátriumkarbonát-oldattal 60 °C-on, amikor is valamennyi észterkötés elhasadt, és kvantitative mértük gázkromatográfiával a felszabadult metilalkohol mennyiségét Az N-acetil-neuraminsavat Svennerholm módszerével határoztuk meg. 4. példa A Gmi gangliozid etilésztere A Gmi gangliozid etilészterét hasonló módon állíthatjuk elő és különíthetjük el, mint a metilésztert az 1. példában, azonban metilakohol és a nátriummetilát helyett etilalkoholt és nátriumetilátot alkalmazunk. A belső észter és a nátriumetilát között ugyanolyan mólarányt állítunk be, mint az 1. példában a belső észter és a nátriummetilát között van. A Dowex gyanta mosását etilakohollal végezzük, a szűrletet bepárlása utáni maradékot pedig diklórmetán és etanol 1:1 arányú elegyének 50 ml mennyiségében oldjuk. 4,9 g nyers terméket kapunk, amelynek tisztítását szintén az 1. példában leírt módon végezzük. így 4,3 g tisztított Gmi gangliozid-etilésztert kapunk. A terméknek az 1. példa szerint kivitelezett kromatográfiás analízise azt mutatja, hogy egységes vegyület van jelen, amelynek Rf-értéke 0,80 s nem mutatható ki sem a Gmi gangliozid, sem a belső észtere (RM),65 illetve 0,75). Nátriumkarbonát-oldattal az 1. példa szerint végzett hidrolízis a Gmi gangliozidot szolgáltatja. A káliumbromid paszás vizsgálat a jel-nél. 5. példa Gangliozidkeverék etilésztereinek keveréke Az etilészterek keverékét hasonló módon állítjuk elő és különítjük el, mint a metilészterekét a 3. példában, azonban metilakohol és nátriummetilát helyett etilalkoholt és nátriumetilátot használunk. 5 g belső észterkeverékből és 318 mg (5,86 mM) nátriummetilátból indulunk ki. tillan végzett infravörös spektroszkopi lemző észtersávot mutatja 1750 cm’ A Dowex gyantát etilakohollal mossuk, a szűrlet bepárlása utáni maradékot pedig kloroform és etanol 1:1 arányú elegyének 50 ml mennyiségében oldjuk. 4,9 g nyers terméket kapunk, amelynek a tisztítását 5 szintén a 3. példában leírtak szerint végezzük. 4,5 g tisztított etilészter-keveréket kapunk. A káliumbromid pasztillán végzett infravörös spektroszkópia a jellemző észtersávot mutatja 1750 cnr'-nél. Ha a terméket szilikagél lemezen kromatografáljuk, futtató 10 oldószerként kloroform, metanol és tetrametil-ammónium-hidroxid (1M oldat) 55:45:10 arányú elegyének alkalmazásával, és a kimutatást Ehrich-reagenssel végezzük, a termékre 0,50-0,75 közötti Rf-értéket kapunk, míg a gangliozidkeverék Rf-értéke 0,20-0,60. 15 A teljes mértékű átésztereződést ugyanúgy mutatjuk ki, mint azt a 3. példában leírtuk. 6. példa A Gmi gangliozid izopropilésztere 20 Ezt a származékot hasonló módon állítjuk elő és különítjük el, mint a metilésztert az 1. példában, azonban metilalkohol és nátriummetilát helyett izopropilalkoholt és nátriumizopropilátot alkalmazunk. A belső észter és a nátriumizopropilát között szintén 25 olyan mólarányt állítunk be, mint az 1. példában a belső észter és a nátriummetilát között. A Dowex gyantát izopropilalkohollal mossuk, s a szűrletet bepárlása utáni maradékot diklórmetán és izopropanol 1:1 arányú elegyének 50 ml mennyiségében oldjuk. 30 4,9 g nyers terméket kapunk, amelyet az 1. példában leírt módon tisztítunk. 4,2 g tisztított Gmi gangliozid-izopropilésztert kapunk. A termék kromatográfiás analízise, az 1. példában leírtak szerint végezve, egységes vegyület jelenlétét 35 mutatja, amelynek Rf- értéke 0,85. A Gmi gangliozid és a belső észtere nincs jelen. Ha a terméket nátriumkarbonáttal hidrolizáljuk az 1. példában leírtak szerint, a Gmi gangliozidot kapjuk. A káliumbromid pasztillával végzett infravörös 40 spektroszkópiánál a jellemző észtersávot figyelhetjük meg 1750 cm*1 értéknél. 7. példa Gangliozidkeverék izopropilésztereinek keveréke 45 Ezt a keveréket hasonló módon állítjuk elő és különítjük el, mint a metilészterek keverékét a 3. példában, azonban a metilalkohol és a nátriummetilát helyett izopropilalkoholt és nátriumizopropilátot használunk. 5 g belső észterkeverékből indulunk ki, és 50 537 mg (6,52 mM) nátriumizopropilátot alkalmazunk. A Dowex gyantát izopropilalkohollal mossuk, a szűrlet bepárlása utáni maradékot pedig kloroform és izorpopanol 1:1 arányú elegyének 50 ml mennyiségében oldjuk. 4,9 g nyers terméket kapunk, amelyet szintén 55 a 3. példában leírtak szerint tisztítunk, azonban a kromatografálásnál eluálószerként kloroform, izopropilalkohol és víz 20:60:8 arányú elegyét alkalmazzuk. A tisztított izopropilészter-keverék mennyisége 4,3 g. Az 5. példában leírt módszerrel végzett kroma- 60 tográfiás vizsgálatnál a termék Rf-értéke 0,40-0,78 (a gangliozidkeverék Rf-értéke 0,20-0,60). A káliumbromid pasztillán végzett infravörös spektroszkópia a jellemző észtersávot mutatja 1750 cnr’-nél. Az átészterezés teljes mértékű lejátszódását a 3. példában 65 leírt módon igazolhatjuk. 9
