199860. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gangliozid-származékok és ilyen hatóanyagot tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
1 HU 199860 B 2 don acilezzük, például savhalogeniddel vagy savanhidriddel, előnyösen tercier bázis, például piridin vagy kollidin jelenlétében. A reakció lefolytatható alacsony hőmérsékleten, például szobahőmérsékleten, és ekkor a savszármazékkal, például a savanhidriddel a reagáltatást viszonylag hosszú ideig, így 12-24 órán át végezzük, vagy reagáltatunk kissé magasabb hőmérsékleten, például 50-100 'C-on, és a reakcióidő ekkor mindössze néhány óra. A találmány az új gangliozid-származékok előállításánál az eljárás olyan módosításaira is kiterjed, amikor az előállítást egy közbenső vegyülettel kezdjük meg, és a hátralévő lépéseket végezzük el, vagy amikor a kiindulási anyagot in situ állítjuk elő. A találmányt az alábbi példák segítségével részletesen ismertetjük. A 36. és 37. példa nem a találmány szerinti eljárásra vonatkozik, hanem hasonló ismert eljárást szemléltet, mellyel a találmány szerinti eljárás összehasonlítható. 1. példa A Gmi gangliozid metilésztere 5 g (3,27 mM) gangliozid belső észtert diklórmetán és metanol 4:1 arányú vízmentes elegyének 200 ml mennyiségében oldunk. 50 ml vízmentes metanolban oldott 176 mg (3,27 mM) nátriummetilátot adunk hozzá, és a reakcióelegyet 2 órán át forraljuk visszafolyató hűtő alatt. A reakció végén Dowex AG 50x8 vízmentes gyantával (H+ alakban van) semlegesítjük, a gyantát szűréssel elválasztjuk, metanollal mossuk, és az oldatot szárazra pároljuk. A maradékot diklórmetán és metanol 1:1 arányú elegyének 50 ml mennyiségében felvesszük, és a kapott oldatot 250 ml acetonban öntve a reakcióterméket kicsapjuk. A kapott 4,9 g nyers terméket preparatív nagynyomású kromatográfiával tisztítjuk 60 H Merck szilikagélen. Oldószerként kloroform, metanol, izopropanol és 2 %-os ammóniumkarbonát 1140:820:180:140 arányú elegyét használjuk. A tiszta terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük, szárazra pároljuk, a maradékot kloroform és metanol 1:1 arányú elegyének 15 ml mennyiségében oldjuk, és a terméket kicsapjuk 75 ml acetonnal. Ilyen módon 4,2 g Gmi gangliozid-metilésztert kapunk. A káliumbromid pasztillával végzett infravörös spektroszkópia a jellemző észtersávot mutatja 1750 cnr'-nél. A szilikagél lemezeken végzett kromatográfia (futtató oldószer kloroform, metanol és 0,3 %-os kalciumklorid 55:45:10 arányú elegye, előhívószer Ehrlichreagens) azt mutatta, hogy a termék egységes vegyület (Rf-értéke 0,72), amely mentes a kiindulási anyagként alkalmazott belső észtertől (Rf-értéke 0,75) és a Gmi gangliozidtól (Rf-értéke 0,65). Ha a terméket 0,1 N nátriumkarbonát-oldattal kezeljük 60 °C-on 1 órán át, az észterkötés elhasad, és Gmi gangliozidot kapunk. 2. példa Gangliozid keverék előállítása szarvasmarha agyszövetből történő extrakcióval, és a megfelelő belső észterek keverékének előállítása (a további példákban történő felhasználás céljára) A szarvasmarhából eltávolított agykérget 6,8 pH- értékű foszfát pufferben homogenizáljuk, 6 térfogatrész tetrahidrofuránt adunk hozzá, és a kapott elegyet centrifugáljuk. A felülúszó folyadékot kétszer extraháljuk tetrahidrofuránnal. Centrifugálás után az apoláros anyagokat etiléterrel eltávolítjuk, és a vizes tetrahidrofurános fázist ioncserélő oszlopra visszük fel, amelyet 50 %-os etanollal hoztunk egyensúlyba. Az oszlopról távozó folyadékhoz báriumhidroxidot és 4 térfogatrész jéghideg etanolt adunk. 18 órás hűtés után a csapadékot elkülönítjük, vízben oldjuk, és sósavval kissé megsavanyítjuk. A kapott oldatot dializáljuk és fagyasztva szántjuk. Ekkor a felhasznált idegszövet minden grammjából körülbelül 0,6 mg nyers gangliozid keveréket kapunk. A fagyasztva szárított port kloroform és metanol 2:1 arányú elegyének 20 térfogatrész mennyiségében diszpergáljuk, a kapott oldatot szűrjük, amíg teljesen tiszta nem lesz, majd 0,88 %-os vzes káliumkloridoldatot adunk hozzá 0,2 térfogatrész mennyiségben. A felső fázist elválasztjuk, dializáljuk és fagyasztva szárítjuk. Végül mintegy 0,3 mg tisztított gangliozidsó-keveréket kapunk minden gramm felhasznált agyszövetből. A fentiek szerint előállított 5 g keveréket 50 ml dimetilszufoxidban oldunk. 4 g sztiroltípusú, vízmentes (szulfonsav) gyantát (50-100 mesh méretű, H+ alakban) adunk az oldathoz, és a kapott rendszert 30 percig keverjük szobahőmérsékleten. Az ioncserélő gyantával végzett kezelés hatására a só formájában jelenlevő karboxilcsoportok átalakulnak. Azt, hogy az átalakulás teljesen megtörtént, alkalmas fizikai analitikai módszerrel, például atomabszorpcióval ellenőrizzük. Ezután a gyantát vákuum alkalmazásával szűrjük, a szűrletet 1,5 g diciklohexil- karbodiimidet adunk, és az elegyet 1 órán át állni hagyjuk.. A kivált diciklohexil-karbamidot szűrjük, a szűrletből a belső gangliozid-észtereket kicsapjuk. 4,6 g belső észterkeveréket kapunk, a termelés 90-95 %. A belső észterszármazékok jelenlétét infravörös spektroszkópiával, majd rétegkromatográfiával erősítjük meg. Infravörös spektroszkópia (káliumbromid pasztilla): az észterező laktonkötés sávot hoz létre 1750 cnr’-nél. Vékony-rétegkromatográfia: szilikagél lemez, oldószer kloroform, metanol és 0,3 %-os kalciumklorid-oldat 55:45:10 térfogatarányú elegye. A belső észterkeverék Rf-értéke 0,7 és 0,85 között van. A végtermékek Rf-értéke nagyobb a kiindulás anyagkeverék Rfértékénél, következésképpen a kromatográfia azt mutatja, hogy kiindulási anyag nincs jelen. 0,1 N nátriumkarbonát-oldattal 60 ’C-on 1 órán át végzett kezelés hatására az észterkötések elhasadnak. Ilyen módon visszakaphatjuk a kiindulási gangliozidok keverékét. A kapott ganghoz idkeveréket különféle részletekre választhatjuk szét, amelyek lényegében a tiszta gangliozidokat képviselik (a leírásban alkalmazott értelemben). Ehhez kovasav oszlopokat használunk, amelyeket metanol és kloroform elegyével eluáljuk. Az így kapott átlagos készítmény 40 % Gúla gangliozidot, 21 % Gmi gangliozidot, 19 % Grib gangliozidot és 16 % GDib gangliozidot tartalmaz. 3. példa Gangliozidkeverék metilésztereinek keveréke Egy gangliozidkeverék belső észterei keverékéből 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
