199783. lajstromszámú szabadalom • Eljárás vinblasztin-antitest konjugátumok és ezeket tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
1 HU 199783 B 2 nátrium-acetát pufferban (pH 5,6) (29,3 g nátriumacetát, 2,44 ml ecetsav, és annyi sterilezett víz, hogy 4 liter puffer keletkezzék.). Az így készített oldathoz 0-2 “C hőmérsékleten 2,1 mg nátrium-perjodátot adunk élénk keverés mellett. A keveréket 10 percen át keverjük 0-2 °C hőmérsékleten sötétben, majd a reakciót leállítjuk etilénglikol 12,5 mól/literes steril vizes oldata 0,004 ml-ének hozzáadásával. Az új keveréket 0-2 °C hőmérsékleten 5 percen át keverjük sötétben, majd centrifugáljuk, hogy tiszta felülúszdt és fehér üledéket kapjunk. A felülúszót Sephadex G25 gél oszlopra (közepes szemcseméret) terheljük, és a terméket azonos nátrium-acetát puffénál eluáljuk. Az eluátumot UV fénnyel (280 nm) követjük. Az oxidált termék koncentrációját minden eluátum frakcióban felbecsüljük 280 nm-en. Az oxidált termék fenti eluátum oldatának végső fehérje koncentrációja 2,5 mg/ml és teljes térfogata 3,1 ml. Az oldatot mintegy 4 °C hőmérsékletre lehűtjük. 4-dezacetil VLB 3-karboxi-hidrazid-szulfát 13,4 mg-os adagját hozzáadjuk a lehűtött, pufferolt MoAb oldathoz. A reakcióedényt nitrogéngázzal átöblítjük, majd lezáijuk. A reakciókeveréket hidegben és sötétben keverjük 16 órán át. A reakcióedényt ezután kinyitjuk, és a tiszta, halványsárga reakciókeveréket kromatografáljuk Sephadex G25 gélen, amelyet előzőleg foszfáttal pufferolt fiziológiás sóoldattal egyensúlyoztunk ki (pH 7,4; 0,01 mól/1 foszfát, 0,15 mól/1 NaCl); ugyanilyen oldatot használunk eluáló szerként is. A konjugátum elsőnek eluálódik, ezt követi az el nem reagált 4-dezacetil VLB 3-karboxi-hidrazid. A kapott konjugátum kitermelése 5,7 mg, 4,8 ml-ben. A konjugációs arány mintegy 5,2 mól 4-dezacetil- VLB-3-karboxi-hidrazid egy mól ZCE- 025-re (a továbbiakban: MoAb) számítva, amint ezt kettős hullámhosszú UV spektroszkópiás méréssel (280 és 270 nm-nél) meghatározzuk. 2. példa 10 mg mintát ugyanabból a MoAb-ből 1 ml acetát pufferben oxidálunk 21 percen át 0 °C hőmérsékleten 34 mg nátrium- perjodáttal. A reakciót azután leállítjuk 0,064 ml 12,5 mól/literes etilénglikollal, és a terméket ugyanúgy tisztítjuk, mint az 1. példában; így 9,7 mg oxidált MoAb-ot kapunk 4 ml oldatban. Ehhez az oldathoz 0 °C hőmérsékleten hozzáadunk 17 mg 4-dezacetil-VLB-3-karboxi-hidrazid-szulfátot, és a keveréket 4 °C hőmérsékleten sötétben állni hagyjuk 16 órán át. A reakciókeveréket azután 20 percen át centrifugáljuk, és a felülúszót feldolgozzuk olyan módon, ahogyan az 1. példában leírtuk; így 0,6 mg terméket kapunk, amelynek konjugációs aránya 27,2. 3 3. példa Az 1. példa eljárásához hasonló eljárást végzünk. A nátrium- metaperjodát mennyisége 2,1 mg, és az oxidáció 21 percig tart. Oxidált MoAb-ből 8,8 mg-os kitermelést kapunk, és ezt reagáltatjuk 19 mg 4-dezacetil-VLB-3-karboxi-hidraziddal, és úgy dolgozzuk fel, ahogyan ezt a 2. példában leírtuk. Ilyen módon 6,9 mg konjugátumot kapunk 8,6 konjugációs aránnyal. 4. példa A 3. példa eljárását ismételjük meg, azzal a kivétellel, hogy a nátrium-perjodát mennyisége 8,6 mg és az etilénglikol mennyisége 0,016 ml. Az oxidált MoAb kitermelése 8,6 mg, amelyet 18 mg 4- dezacetil-VLB-3-karboxi-hidraziddal reagáltatunk. 5 mg kívánt konjugátumot kapunk, amelynek konjugációs aránya 13,8. 5. példa A 3. példa eljárását ismételjük meg újból, azzal a kivétellel, hogy a nátrium-perjodát mennyisége 8,6 mg és az etilénglikol mennyisége 0,016 ml, és az oxidációs idő 10 perc. Az oxidált MoAb-ből 8,1 mg kitermelést kapunk. Ennek reagáltatása 19 mg 4- dezacetil-VLB-3-hidroxi-hidraziddal 6,5 mg konjugátumot termel, amelynek konjugációs aránya 10,3. A fenti példákban készített konjugátumoknál radioimmunassay-val és immunfluoreszcenciával határozzuk meg, hogy legalább olyan jól kötődnek az antigén-pozitív LS174T humán végbél adenokarcinóma sejtekhez, mint a nem konjugált ZCE-025 sejtek. Az immunfluoreszcenciával végzett elemzés megmutatja, hogy a konjugátumok nem kötődnek az antigén-negatív M14 humán melanoma sejtekhez. 6. példa ZCE-025 antitest 374 mg-os adagját dializáljuk 28,8 ml nátrium- acetát pufferral (pH 5,6) szemben, majd ezt 0,53 ml vizes nátrium-perjodát oldattal (150 mg/ml) egyesítjük. A keveréket 10 percen át sötétbenkeverjük, majd a reakciót leállítjuk etilénglikol hozzáadásával. A reakciókeveréket azután centrifugáljuk, és a felülúszót kromatografáljuk Sephadex G25-ön, és nátrium-acetát pufferral eluálunk. Az antitest-tartalmú frakciókat egyesítjük, és UV spektroszkópiával elemezzük 280 nm- nél, amely azt mutatja, hogy 355 mg oxidált antitestet nyertünk ki. Ezt 2,8 mg/ml koncentrációra hígítjuk nátrium-acetát pufferban, és ehhez hozzáadunk 554 mg 4-dezacetil-VLB-3-karboxi- hidrazidot. A reakciókeveréket egy éjszakán át állni hagyjuk 4 °C hőmérsékleten, és a keveréket Sephadex G25-ön végzett kromatográfiával tisztítjuk úgy, hogy pufferolt fiziológiás sóoldattal (pH 7,4) eluálunk. A terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük, és 0,2 p-os membránon átszűrjük. Összesen 304 mg konjugátumot kapunk, 13,5 mg/ml koncentrációban, a VLB 5,0 mól konjugációs arányával egy mól antitesthez viszonyítva. 7. példa Lényegében a 6. példát ismételjük meg azzal a módosítással, hogy nagyobb konjugációs arányú terméket állítunk elő. A nátrium- perjodát oldat mennyisége 6,4 ml 150 mg/ml koncentrációnál, és az oxidációs reakciót 21 percig hagyjuk végbemenni. Ugyanolyan mennyiségű 4-dezacetil-VLB-3-kaíboxihidrazidot alkalmazunk, és a termék 187 mg konjugátumot tesz ki 8,9 mg/ml koncentrációnál 9,7 mól VLB/móI fehérje konjugációs aránnyal. A 6. és 7. példa konjugátumait nőstény Charles River meztelen egereken növekvő LS174T tumor xenograftjai ellen vizsgáljuk. Az LS174T emberi végbél tumor, amely karcinoembrionális antigént termel. A vizsgálat úgy kezdődik, hogy az egerekbe szubkután 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
