199783. lajstromszámú szabadalom • Eljárás vinblasztin-antitest konjugátumok és ezeket tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
1 HU 199783 B 2 (iv) tüdőkarcinóma sejtekkel vagy sejtfrakciókkal immunizált kecskékből vagy birkákból származó IgG; (v) humán végbélkarcinóma elleni antitesteket kiválasztó egér hibridómákból származó monoklonális IgG; (vi) humán melanóma elleni antitesteket kiválasztó egér hibridómákból származó monoklonális IgG; (vii) olyan egér hibridómákból származó monoklonális IgG, amely hibridóma humán leukémia sejtekkel reagáló antitesteket választ ki; (viii) emberi neuroblasztóma sejtekkel reagáló antitesteket kiválasztó egér hibridómákból származó monoklonális IgG; (ix) emberi mellrák antigénekkel reagáló antitesteket kiválasztó egér hibridómákból származó monoklonális IgG; (x) emberi petefészek sejtekkel reagáló antitesteket kiválasztó egér hibridómákból származó monoklonális IgG; (xi) emberi csont-szarkóma sejtekkel, emberi hasnyálmirigy karcinóma sejtekkel, emberi prosztata karcinóma sejtekkel, stb. reagáló antitesteket kiválasztó egér hibridómákból származó monoklonális IgG; (xii) adenokarcinómák (ideértve a tüdő-, vese-, mell-, és hasnyálmirigy karcinómákat) elleni antitesteket kiválasztó egér hibridómákból származó monoklonális IgG; (xiii) emberi pikkelyes karcinóma sejtekkel reagáló antitesteket kiválasztó egér hibridómákból származó monoklonális IgG; (xiv) emberi hibridómákból származó monoklonális IgG (ezek olyan hibridómák, amelyek emberi tumorral társult antigén elleni antitesteket választanak ki, beleértve a fentebb említett monoklonális antitesteket, de nemcsak azokra korlátozva). Az előnyös konjugátumok azok, amelyeket monoklonális antitestekből állítunk elő, előnyösen azokból, amelyek emberi ráksejteket ismernek fel, ilyenek pl. az adenokarcinóma, pikkelyes sejt karcinóma, átmeneti sejt karcinóma, melanóma, neuroblasztóma, kissejtes karcinóma, leukémia, limfóma, és szarkóma. Az antitestet a vinka hidraziddal való reakcióhoz úgy készítjük elő, hogy peijodáttal vagy más megfelelő oxidálószerrel oxidáljuk úgy, hogy a felületi szénhidrátokban levő vicinális diolok közti kötések felhasadnak, és ezáltal az eredeti kötés mindkét oldalán aldehidcsoportok alakulnak ki. A vegyészek jól tudják, hogy az aldehidcsoport, amikor oldatban van más működőképes reagensek jelenlétében, valójában lehet acetál, hemiacetál, aminál, hemiaminál, stb. formájában. Az aldehid képződés kialakulát az 1. folyamatábra vázolja fel. Az oxidálódó szénhidrát egységek aránya és a termelt dialdehid egységek száma az alábbi tényezők eredménye, amelyet ismernek azok, akik a szakterületen jártasak: az alkalmazott peijodát mennyisége, az oxidálás általános reakciókörülményei (pl. az idő, hőmérséklet, oldószer, koncentráció, stb.), az antitesten jelen levő vicinális diói szénhidrát egységek száma, és hozzáférhetőségük az oxidáló reagens számára. Egy másik módszer szerint, vagy a fenti perjodátos oxidációval kombinálva, lehet alkalmazni enzimes oxidálást is, például galaktóz oxidázzal. Ez szelektívebb és korlátozottabb reagens, amely a galaktóz gyök 6-CH2OH helyének átalakítását katalizálja a szénhidrát egységen aldehid funkciókká. Ennek a 6- CH2OH csoportnak helyettesítetlennek kell lenni, hogy a sikeres oxidáció lehetségessé váljék, és egy blokkolt csoport, pl. olyan csoport, ahová sziálsav gyök van kötve, gátlás- mentesítését a neuramidináz enzimmel lehet elvégezni. Akárcsak fentebb, az így létrejött aldehid-maradékok száma sokféle változó függvénye. Az oxidált antitestet azután valamely (I) általános képletű vinka hidraziddal konjugáljuk nukleofil reakcióban, ahol a magányos elektronpár a hidrazid csoport terminális nitrogénjén megkeresi az oxidált antitest aldehid csoportját. Általában minden mól antitest egy bizonyos számú mól vinka hidraziddal konjugálódik. A jelen találmány előnyeinek egyike a gyógyszernek az a nagy száma, amelyet az egyes antitest molekulákra rá lehet terhelni. A .konjugációs arány” kifejezést a vinka hidrazidok móljainak átlagos számára alkalmazzuk egy mól antitestre. A konjugációs arány a jelen találmányban általában 5 és 35 között van, és az 5 és 25 közötti tartományban levő konjugációs arányok az előnyösek. További előnyös konjugációs arány tartományok a 10 és 20, a 15 és 25, és az 5 és 15 közöttiek. A vinka hidrazidok konjugálását oxidált antitestekkel a szakterületen ismert standard módszerekkel végezhetjük el. Általában valamely (II) általános képletű vinka vízzel elegyedő oldószerrel, pl. dimetilformamiddal képzett oldatát az oxidált antitest lehűtött, pufferolt vizes oldatához adjuk. A vinkát lehet alkalmazni szulfát-sóként, amely esetben szerves oldószerre nincs szükség. Előnyösek a 0-8 °C közti hőmérsékletek, és általában 0,1 n nátrium-acetát puffert alkalmazunk. A reakciót sötétben és inert atmoszférában a legjobb elvégezni. A reakció általában mintegy 10-24 óra alatt válik teljessé, és az így létrejött konjugátumot standard módszerekkel, pl. Sephadexen végzett kromatográfiával lehet tisztítani. Az alábbi példákban alkalmazott MoAb (monoklonális antitest) a ZCE-025, IgGi alosztályú rágcsáló antitest, amely karcinoembrionális antigénnel reagál. Ezt a Hybritech Incorporated fejlesztette ki [Abdel- Nahi és munkatársai: Radiology, 164, 617-21 (1987)]. Ezt az antitestet bizonyos ideje már tanulmányozzák Mach J. R és munkatársai elsősorban rákdiagnosztikai szerként, 35. monoklonális antitest néven [lásd még: Delaloye és munkatársai: J. Clin. Invest. 77, 301-11 (1986); Haskell és munkatársai: Cancer Res. 43, 3857-4)4 (1983); Sutherland és munkatársai: Cancer Res. 47, 1627-33 (1987)]. A ZCE-025-ről úgy találták, hogy szokatlanul nagy a molekulatömege (28000), SDS-PAGE vizsgálattal (gélelektroforézis) végzett elemzéssel redukáló körülmények között. Ezt a vizsgálati módszert Laemmli írja le [Nature (London) 227, 680-85 (1970)]. A ZCE-025 kezelése endoglikozidáz F-fel [Elder és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 70, 4540-44 (1982)] azt idézi elő, hogy a könnyű lánc nagy része az SDS-PAGE-on azonos területen vándorol, mint a kontroll, azt jelezve, hogy a könnyű lánc nagy molekulatömegét szénhidrát okozza. 1. példa 10 mg ZCE-025-öt feloldunk 1 ml 0,1 mól/literes 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
